復合石油降解菌的構建及其降解石油效果的探究

鄢雨朦，付保榮

(遼寧大學 環境學院，遼寧 沈陽 110036)

1 引言

現在，生物修復技術已變成對生態環境進行保護過程中的一類最有價值的修復手段[1]，石油污染土壤的生物修復不僅可以有效地降解石油，而且可以有效地降低修復石油污染土壤時帶來的生物入侵風險。利用微生物進行石油污染土壤的修復擁有操作便捷、成本低、無二次污染、不損害土壤構造等優勢[2,3]。自然環境中很多微生物，能夠只把石油烴當作碳源和能源，借助氧化、脫氫等可以發生在細胞內、外的通過酶促進的反應，從而將石油烴降解成水、二氧化碳和其他代謝產物[4,5]。這類微生物有種別多、遍布范圍廣、繁殖快、個體小、比表面積大和易變異的特征，這使其在修復被石油污染土壤的時候體現出效率高且多樣的性質。微生物對石油烴污染物的降解取決于石油烴污染物的量、狀況、環境條件以及微生物群落構成[6]。

本文研究了兩株石油降解菌進行組合后降解石油的效果，將篩選出的兩株石油降解菌2#、3#進行復配，構建復合石油降解菌。將復合石油降解菌應用在石油污染控制中，不僅能夠高效治理石油污染的環境，還為石油降解菌進一步修復石油污染土壤提供了依據。

2 實驗材料

2.1 培養基

(1)石油無機鹽培養基：K2HPO46 g，KH2PO46 g，(NH4)2SO46 g，NaCl 5 g，石油1 g，pH值為7.0，蒸餾水1000 mL。固體培養基在此基礎上加入瓊脂15～20 g即可。

(2)牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 mL，pH值為7. 0～7.2，121 ℃滅菌20 min。固體培養基在此基礎上加入瓊脂15～20 g即可。

2.2 實驗試劑

石油、石油醚。

2.3 實驗所需菌株

前期實驗富集分離純化得到的石油降解菌2#和3#。

2.4 主要儀器設備

探究過程主要使用的儀器設備見表1。

表1 主要實驗儀器設備

3 復合石油降解菌的構建及其對石油降解情況的探究

3.1 復合石油降解菌的構建

首先，將在4 ℃冰箱中存留的菌種培養基在35 ℃恒溫培養箱中培養24 h 后，在潔凈工作臺上先用酒精燈外焰對接種環滅菌，等其冷卻后挑取試管內單一完整的菌落，分別轉接到平板固體培養基上，在35 ℃恒溫培養箱中培養24 h。分別取一環活化的單菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，置于條件設置為35 ℃、轉速150 r/min的恒溫搖床中振蕩培養24 h，使菌株大量生長。將通過上述過程得到的單菌株菌液分別以1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2的比例混合制備得到混合菌株菌液，構建降解石油的復合菌(圖1)。

3.2 復合石油降解菌對石油降解情況的探究

將2.5 mL(體積分數為5%)混合菌株的菌液接入50 mL石油無機鹽培養液，將不接菌液的培養基作為空白對照。其培養與條件設置為35 ℃、150 r/min的恒溫搖床中培養6 d。每組樣品做3個平行樣。

在取出的培養液中加入石油醚進行萃取，并將萃取液在5000 r/min的條件下進行離心10 min，轉入分液漏斗，靜置分層，收集上清液。反復三次用石油醚洗滌，合并上層萃取液。加入2 g無水Na2SO4過濾，隨即裝入10 mL容量瓶中，用石油醚定容到刻度線。之后采用紫外分光光度法測定石油降解率[7]，利用紫外-可見分光光度計在254 nm波長處依次對萃取液進行吸光度值的測定，以石油醚為空白。經由標準曲線計算石油的剩余量，并借助下述公式計算得出菌株的石油降解率。

單菌株在菌群中所占比例及不同比例的單菌構成的復合菌降解石油的效率如表2所示。

表2 復合菌的石油降解率

圖1 菌株投加比例對菌株降解率的影響

通過表2可以看出，五組復合石油降解菌培養6 d后的石油降解率分別為35.09%、40.08%、55.03%、62.66%、52.88%。實驗得出菌株的最佳復配比為2∶3，此時復合石油降解菌的石油降解率可達到62.66%。前期實驗得出2#菌株降解石油的效率為21.99%、3#菌株降解石油的效率為30.2%，相比于單菌株石油降解率，復合菌降解石油的效率分別提高了約40.67%、32.46%。實驗結果表明復配后的菌株對石油烴的降解效果均優于單菌株，能夠較好的進行石油的降解，為后續菌株降解石油的應用提供指導。

4 結語

實驗得出菌株的最佳復配比為2∶3，此時復合石油降解菌的石油降解率可達到62.66%，相比于單菌株石油降解率，復合菌降解石油的效率提高了約32.46%。實驗結果表明復配后的菌株對石油烴的降解效果均優于單菌株，其不僅能夠用來治理石油污染的環境，還能夠為石油降解菌進一步運用在修復石油污染土壤中提供依據。