谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶抑制腦損傷后炎癥反應(yīng)的研究

張岱男 周世芳 肖 萌 馬順昌△

1）首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100070 2）河南省神經(jīng)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院），河南 衛(wèi)輝 453100

創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病之一，僅次于四肢傷，主要因交通事故和暴力事件所致，對(duì)人類生命及生活質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅。按照TBI發(fā)生的時(shí)間和類型可分為原發(fā)性（直接）顱腦損傷和繼發(fā)性（間接）顱腦損傷，繼發(fā)性顱腦損傷引起的興奮性氨基酸毒性、顱內(nèi)高壓、腦組織缺血缺氧、腦能量代謝紊亂等是導(dǎo)致后期高致死率、高致殘率的常見(jiàn)原因，與患者預(yù)后密切相關(guān)［1-2］。谷氨酸（GLU）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的快速興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，過(guò)量產(chǎn)生可經(jīng)N-甲基-D-天門冬氨酸鹽（NMDA）受體引起鈣離子超載與非NMDA受體通路增加炎癥損傷，加重神經(jīng)功能損害、腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等改變，是造成繼發(fā)性腦損傷病情加重的主要原因。TBI后炎性因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）表達(dá)升高介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性顱腦損傷中發(fā)揮重要作用［3］。因此，如何尋找可靠的治療手段減輕炎癥反應(yīng)，從而減少神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，減輕繼發(fā)性腦損傷，提高患者的生存率，已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)［4］。GLU與草酰乙酸（OxA）經(jīng)谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）催化產(chǎn)生天冬氨酸與α-酮戊二酸。研究發(fā)現(xiàn)，GOT降低外周血中谷氨酸濃度，是通過(guò)增強(qiáng)跨血腦屏障的谷氨酸穩(wěn)態(tài)加速中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸清除，進(jìn)而降低其興奮性毒性，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用［5-6］。研究表明，GOT在缺血再灌注大鼠模型中減少梗死面積并短暫消除長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）的抑制［7-8］。此外，GOT在卒中、阿爾茨海默病及其他神經(jīng)退行性疾病的動(dòng)物模型中均具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用［9-11］，但其對(duì)TBI患者中樞系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的影響目前尚不明確。本研究通過(guò)構(gòu)建TBI大鼠閉合性顱腦損傷模型，觀察炎性細(xì)胞因子的釋放是否具有時(shí)間依從性，探討GOT能否抑制TBI后繼發(fā)性腦損傷的炎癥反應(yīng)，以及向臨床轉(zhuǎn)化的潛力。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及藥物干預(yù)健康成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自北京維通利華有限公司。將大鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組（Sham組）12只，腦損傷組（TBI組）12只，GOT給藥組（GOT+TBI組）12只。TBI+GOT組經(jīng)頸部皮下注射GOT 0.3 mg/kg，1次/d，連續(xù)注射1周；Sham組和TBI組注射等量生理鹽水，注射方式和注射次數(shù)與TBI+GOT組保持一致。

1.2大鼠腦損傷模型制作利用改良Feeney DM自由落體硬膜外撞擊法制作TBI模型：氯胺酮60 mg/kg腹腔注射麻醉SD大鼠，俯臥位固定，剃去大鼠毛發(fā)，消毒，沿中縫位置切開(kāi)頭部皮膚，剝離軟組織和骨膜，于顱骨中線右側(cè)旁3 mm、人字縫前3 mm開(kāi)一5 mm的圓形骨孔，硬膜保持完好，利用自由落體打擊裝置，將50 g砝碼從20 cm高處落下，撞擊置于硬腦膜上的圓錐，使其發(fā)生腦損傷，骨蠟封閉后，縫合頭皮。Sham組不做撞擊。

1.3標(biāo)本制備模型制作成功后，分別于12 h、1 d、3 d、5 d取標(biāo)本。在不同的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取損傷的大腦組織，按照腦濕質(zhì)量∶生理鹽水=1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，冰上研磨，制備腦組織勻漿，3 000 r/min、4℃離心15 min，取上清液，80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4檢測(cè)方法ELISA檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，按照試劑盒說(shuō)明數(shù)書(shū)操作，加樣后，封板于37℃敷育90 min，洗3次，加入Biotinylated antibody工作液，37℃敷育90 min，洗3次，加入streptavidin-HRP工作液37℃敷育30 min，洗3次，加入TMB，37℃避光敷育5～30 min，期間觀察顯色情況，加入Stop solution，酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm處的各孔光密度（optical density，OD）。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中TNF-α和IL-6的濃度。

2 結(jié)果

ELISA檢測(cè)GOT對(duì)SD大鼠TBI后炎性因子的影響，與Sham組相比，TBI和TBI+GOT組腦組織中IL-6的表達(dá)在腦損傷后12 h、24 h顯著升高（P＜0.05），第3天、第5天回歸至Sham組水平；與TBI組比較，TBI+GOT組腦組織中IL-6的表達(dá)在腦損傷后12 h、24 h顯著降低（P＜0.05），第3天、第5天回歸至Sham組水平（表1、圖1）。與Sham組相比，TBI和TBI+GOT組腦組織中TNF-α的表達(dá)在腦損傷后12 h、24 h顯著升高（P＜0.05），第3天、第5天回歸至Sham組水平；與TBI組比較，TBI+GOT組腦組織中TNF-α的表達(dá)在腦損傷后12 h、24 h顯著降低（P＜0.05），第3天、第5天回歸至Sham組水平（表2、圖2）。

表1 腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后IL-6在腦組織中的濃度變化（pg/g，±s）Table 1 Changes in the concentration of IL-6 in brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI（pg/g，±s）

表1 腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后IL-6在腦組織中的濃度變化（pg/g，±s）Table 1 Changes in the concentration of IL-6 in brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI（pg/g，±s）

組別Sham組TBI組TBI+GOT組n IL-6 12 12 12 12 h 601.1±5.71 911.42±2.9 728.8±3.13 1 d 628.47±3.32 1230.44±18.63 986.85±6.85 3 d 609.49±6.11 610.53±17.75 642.35±47.01 5 d 621.94±7.44 607.69±15.48 608.12±33.01

圖1 腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后IL-6在腦組織中的濃度變化Figure 1 Changes in the concentration of IL-6 in brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI

表2 腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后TNF-α在腦組織中的濃度變化（±s，pg/g）Table 2 Changes in the concentration of TNF-αin brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI（±s，pg/g）

表2 腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后TNF-α在腦組織中的濃度變化（±s，pg/g）Table 2 Changes in the concentration of TNF-αin brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI（±s，pg/g）

組別Sham組TBI組TBI+GOT組n TNF-α 12 12 12 12 h 716.83±10.6 808.81±3.79 770.39±5.68 1 d 709.27±4.35 1417.95±22.26 1060.72±307.41 3 d 710.83±1.58 723.84±30.15 697.21±15.05 5 d 721.95±4.89 736.15±37.05 704.92±27.28

圖2腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后TNF-α在腦組織中的濃度變化Figure 2 Changes in the concentration of TNF-αin brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI

3 討論

TBI發(fā)病率逐年增高，已成為威脅人類生命及生活質(zhì)量主要的創(chuàng)傷性疾病之一，是45歲以下個(gè)體死亡的主要原因［12-13］。TBI后繼發(fā)性腦損傷對(duì)預(yù)后具有決定性作用，其病理生理機(jī)制復(fù)雜，主要包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)能量代謝紊亂、神經(jīng)功能障礙、顱內(nèi)高壓、腦微循環(huán)紊亂等［14-15］。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后炎性細(xì)胞因子被激活分泌，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了腦損傷后病理生理演變的全過(guò)程［16-17］。因此，尋找可靠的治療手段減輕炎癥反應(yīng)，減輕繼發(fā)性腦損傷，提高患者的預(yù)后，已成為神經(jīng)病學(xué)及康復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)［4］。

本課題組前期的研究顯示，GOT作為外周谷氨酸清除系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有潛在的保護(hù)作用［9-11］，并且發(fā)現(xiàn)由GOT和草酰乙酸（Oxa）組成的基于外周血的清除系統(tǒng)在缺血再灌注大鼠模型中減少梗死面積［7-8］。GOT催化外周血谷氨酸與Oxa反應(yīng)生成天冬氨酸和α-酮戊二酸，該反應(yīng)為血漿中存在的可逆反應(yīng)，其反應(yīng)方向取決于底物間的相對(duì)濃度［18-19］。該酶化反應(yīng)降低外周血中谷氨酸濃度，增加跨血腦屏障濃度梯度，當(dāng)中樞系統(tǒng)細(xì)胞外液谷氨酸濃度病理性升高時(shí)，加速谷氨酸由中樞系統(tǒng)向外周轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低中樞系統(tǒng)興奮性毒性［5］。

研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷發(fā)生后，短時(shí)間內(nèi)即可啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放各種炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6，破壞血腦屏障，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的重要原因［20-21］。此外，TBI后炎性細(xì)胞因子的超量表達(dá)還可導(dǎo)致鈣離子超載、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等損害性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起神經(jīng)細(xì)胞的變性、壞死；其表達(dá)水平對(duì)創(chuàng)傷后病情評(píng)估、治療措施及預(yù)后都具有重要價(jià)值［22］。TNF-α是TBI后早期釋放的炎性因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要由活化的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，可激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，引起腦組織過(guò)度免疫損傷導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，加速神經(jīng)細(xì)胞的變性、壞死［23］。IL-6在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要由有核細(xì)胞產(chǎn)生，如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，其作為一種重要的炎性介質(zhì)，在損傷早期的腦組織中顯著增高，參與繼發(fā)性腦損傷的過(guò)程［24］。TBI后血腦屏障受到破壞，外周血中的TNF-α和IL-6細(xì)胞因子通過(guò)受損的血腦屏障進(jìn)入腦組織，同時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性因子快速升高，激活損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)免疫損傷，腦血管微環(huán)境改變，毛細(xì)血管通透性增加，形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步加速神經(jīng)細(xì)胞死亡［25-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后腦組織炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平顯著升高，24 h達(dá)到高峰，并于3 d后降低，其變化具有時(shí)間依從性。而給予GOT治療后TNF-α和IL-6的表達(dá)水平在12 h、24 h明顯降低，說(shuō)明TNF-α、IL-6參與了TBI后的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，且GOT干預(yù)后減少了腦組織炎性因子的釋放，抑制了大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Feeney DM自由落體撞擊法制備TBI模型很好地模擬了臨床工作中TBI的損傷特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)TBI后腦組織炎性因子的釋放具有時(shí)間依從性，GOT能夠降低TBI后中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平。GOT可以減輕創(chuàng)傷性腦損傷后的中樞系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，可能有助于減輕繼發(fā)性腦損傷，改善預(yù)后。