線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發作綜合征的分子生物學特征

吳世陶 劉 方 石偉偉 張 敏 李建章 劉恒方△

1）鄭州大學第五附屬醫院，河南 鄭州 450052 2）鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450003

線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發作（mi?tochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes，MELAS）是由于線粒體DNA（mtDNA）或核DNA（nDNA）突變、導致線粒體的結構和功能異常、細胞供能不足引起的一組臨床綜合征［1］。MELAS綜合征發病年齡早、臨床表現復雜、診斷困難，肌肉病理對其診斷具有重要價值，但其為有創性檢查，且兒童患者配合不佳，有一定的局限性?，F在已經進入精準醫學時代，基因檢測是診斷MELAS綜合征的金標準，且是一種無創、準確的方法［2］。ME?LAS綜合征約95%為mtDNA突變，5%為nDNA突變，國外研究發現與MELAS綜合征相關的mtDNA突變有40多種，約80%為3243 A＞G突變，其他突變位點有3271 T＞C、1642 G＞A、3252 A＞G、3260 A＞G、3291 T＞C、8344 A＞G、8993 T＞G、9176 T＞C和13513 G＞A等［3-5］。目前，國外研究方向主要為尋找新的突變位點、分析基因突變的發病機制、研發新藥及基因治療等［6-7］，這是一項長期工程、需要積累大量的MELAS綜合征患者。相比之下，國內對MELAS綜合征基因突變位點、流行病學、突變類型與表型的異質性等研究相對較少。本研究分析42例MELAS綜合征患者及親屬的基因測序結果，分析MELAS綜合征的熱點突變、新發突變及不同組織的突變率等分子生物學特征。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2011-01—2020-01鄭州大學第五附屬醫院和鄭州大學第一附屬醫院經肌肉病理和基因測序同時確診的42例MELAS綜合征患者及親屬的臨床表現、影像學、肌肉病理和基因測序等資料，其中男22例，女20例，年齡4～42歲，病程2個月～11 a。本研究獲得鄭州大學第五附屬醫院倫理委員會的批準，且患者或家屬簽署知情同意書。

1.2肌肉病理患者或監護人簽署知情同意書，局麻下獲得骨骼肌標本，根據病情取材部位為肱二頭肌或腓腸肌。新鮮標本分兩部分，一部分行肌肉組織病理染色，另一部分行電鏡檢查。新鮮肌肉標本經液氮冷卻的異戊烷迅速冷凍，80℃保存，染色時制成8μm冷凍切片，進行蘇木精-伊紅（HE）、改良Gomori（MGT）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶（NADH）、細胞色素C氧化酶（COX）、過碘酸雪夫氏（PAS）和油紅O（ORO）染色，顯微鏡200倍下進行病理分析。

1.3基因測序對42例MELAS綜合征患者及親屬的外周血和新鮮尿液同時進行基因測序，送至武漢康圣環球醫學檢驗所有限公司進行PCR擴增、電泳后產生清晰可見、大小符合預期的條帶，首先采用Sanger法對3243 A＞G、3252 A＞G、3271 T＞C和13513 G＞A常見突變位點進行測序。如果常見突變位點陰性時，應用二代測序檢測線粒體DNA全長，對于明確的致病突變，采用Sanger測序進行驗證。

1.4統計學分析采用SPSS 23.0統計學軟件進行分析，采用秩和檢驗比較血液和尿液中線粒體DNA的突變率。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1肌肉病理42例患者改良Gomori染色可見較多破碎紅纖維，見圖1。

圖1 肌肉病理（×200）Figure 1 Muscle pathology（×200）

2.2基因測序42例MELAS綜合征患者及親屬進行基因測序，42例患者均發現存在mtNDA突變。共發現30例患者存在3243 A＞G突變，血液檢出25例發生3243 A＞G突變，突變率為22.15%～100%（35.82±11.26）%；尿液檢出30例發生3243 A＞G突變，突變率為38.46%～100%（63.57±20.85）%；發現3271 T＞C突變3例，13513 G＞A突變3例，1642 G＞A、3093 C＞G、3256 C＞T、3302 A＞G、3697 G＞A和15242 G＞A突變分別1例。20例患者的親屬存在相同的基因突變位點，其中17例患者的母親、外婆、舅舅、兄弟姐妹或兒女存在相同的3243 A＞G突變位點，3例患者的母親分別存在相同的3271 T＞C、3302 A＞G、3697 G＞A突變位點?；颊?發生3243 A＞G突變，外周血突變率為52.38%，尿液細胞突變率為100%；患者1的母親發生3243 A＞G突變，外周血突變率為9.11%，尿液細胞突變率為59.38%，母親無臨床癥狀，為攜帶者（圖2）?；颊?5發生3093 C＞G突變，外周血突變率為52.68%，尿液細胞突變率為100%（圖3）?；颊?6發生13513 G＞A突變，外周血突變率為77.61%；尿液細胞突變率為100%，為純質性突變（圖4）；患者17出現3697 G＞A突變，外周血和尿液細胞的突變率均為100%；母親的尿液細胞存在相同的3697 G＞A突變，突變率為21.15%，母親沒有臨床癥狀，為攜帶者（圖5）；患者20發生3271 T＞C突變，外周血突變率為69.84%；尿液細胞突變率為100%，為純質性突變；患者20的母親外周血未發生3271 T＞C突變；尿液細胞發生3271 T＞C突變，突變率為17.28%，有臨床表現（圖6）；患者34發生15242 G＞A突變，外周血突變率為42.75%；尿液細胞突變率為49.53%（圖7）。所有患者的父親均未發現基因突變。與外周血的線粒體DNA突變率相比，尿液細胞的突變率顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖2 患者1的基因測序結果Figure 2 The gene sequencing results of case 1

圖3 患者15的基因測序結果Figure 3 The gene sequencing results of case 15

圖4 患者16的基因測序結果Figure 4 The gene sequencing results of case 16

圖5 患者17的基因測序結果Figure 5 The gene sequencing results of case 17

圖6 患者20的基因測序結果Figure 6 The gene sequencing results of case 20

圖7 患者34的基因測序結果Figure 7 The gene sequencing results of case 34

3 討論

人類mtDNA全長16 569 bp，為雙鏈閉式環狀分子，其內環為輕鏈（L-strand），外環為重鏈（Hstrand），編碼22個轉運RNA（transfer RNA，tRNA）、2個核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）（12S、16S）和13個蛋白質［8-9］。目前發現與MELAS綜合征相關的mtDNA基因突變有40多個，分別位于MT CO3、MTNDl、MT-ND4、MT-ND5、MT-CYB和MT-NC6，還位于tRNA和rRNA區域的MT-TLl、MT-TL2、MT-TV、MT-TF、MT-RNR2、MT-TK、MT-TQ和MT-TH，其中文獻報道最多的是MT-TLl基因［10-14］。人類的MTTLl基因全長為75 bp（np3230-np3304），編碼tR?NALeu（UUR）基因，在線粒體內負責轉運亮氨酸，tR?NALeu（UUR）基因含有78個堿基，能夠識別UUA與UUG兩個密碼子［15-16］。目前報道有8個MT-TLl點突變與MELAS綜合征相關，其中3243 A>G是最常見的突變位點［17］。EL-HATTAB等［18］報道約80%的MELAS綜合征患者為3243 A>G突變。本研究中71.43%（30/42）的患者發生3243 A>G突變，稍低于上述報道，但與PICARD等［19］報道54.6%～72.3%的MELAS綜合患者為3243 A>G突變基本一致。mtD?NA亮氨酸tRNA基因3243 A>G導致轉錄終止，影響了tRNA的甲基化、氨酰化及蛋白質合成，造成線粒體呼吸鏈酶復合物Ⅰ和Ⅳ的活性出現缺陷，氧化磷酸化障礙、能量供應不足，從而導致一系列的臨床癥狀［20］。本組30例3243 A>G突變患者主要表現為卒中樣發作、頭痛、癲癇、智能減退、聽力下降、精神異常、身材矮小、不耐受疲勞、視力下降和多毛等。

既往研究報道MELAS綜合征患者約10%為3271 T＞C突變，其他突變占10%［21］。本組僅3例3271 T＞C，占7.14%（3/42），推測可能與人種有關，也可能與樣本量較小有關。近年來國內外陸續報道了60余例13513 G＞A突變導致的MELAS綜合征［22-23］。本研究通過行mtDNA全長測序發現，7.14%的患者出現13513 G＞A，是本組患者中第三大常見的突變位點，提示可以將13513 G＞A作為MELAS綜合征的熱點突變進行篩查。13513 G＞A位于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（nicotinamide adenine dinucleo?tide，NADH）5基因上，是最常見的mt DNA ND5所編碼的基因突變［24］。13513 G＞A突變主要可引起ME?LAS綜合征、Leigh綜合征以及MELAS-Leigh疊加綜合征，這些臨床表型可能與年齡有一定的關系。13513 G＞A突變引起的MELAS綜合征常見于成年人，而其所致的Leigh綜合征常見于嬰幼兒，MELASLeigh疊加綜合征較罕見。本研究中3例13513 G＞A突變，發病年齡分別為26、19.5和23歲，與既往報道一致［25］。

本研究除發現國內外報道過的mtDNA 3243 A＞G、13513 G＞A、3302 A＞G、1642 G＞A、3271 T＞C和3256 C＞T突變位點以外［26］，還發現了3093 C＞G、3697 G＞A和15242 G＞A突變，這3個突變國外已經報道［27-29］，而國內尚未見報道?；颊?5主要表現為頭痛、癲癇、聽力下降，發生3093 C＞G突變，3093 C＞G位于16S rRNA亞基，突變時將導致16S rRNA亞基的結構發生變化，造成線粒體氧化磷酸化障礙?；颊?7主要表現為卒中樣發作、智能減退、視力下降，發生3697 G＞A突變，其母親存在相同的3697 G＞A突變，但無臨床表現。MT-NDl編碼呼吸鏈復合物Ⅰ，該酶是線粒體內膜上完成電子傳遞過程的關鍵酶［30］。m3697位于MT-NDl區域，當正常的G堿基突變為A堿基時，導致第131位甘氨酸被錯誤地翻譯成絲氨酸（p.Gly 131 Ser），改變了MT-ND1的空間結構，從而影響NADH脫氫酶的活性，造成ATP合成減少、細胞能量供應不足。患者34主要表現為智能減退、身材矮小、多毛、不耐受疲勞，發生15242 G＞A突變，m15242位于mtDNA MT-CYB基因上，當正常的G堿基突變為A堿基時，第166位甘氨酸密碼子（GGA）轉換成終止密碼子（AGA），導致轉錄終止，線粒體氧化磷酸化發生障礙。在線粒體內膜上，呼吸鏈復合物Ⅲ是氧化磷酸化電子傳遞過程中的第二個酶，其突變或缺失會影響催化電子從還原型輔酶Q到細胞色素C的轉運，且將質子從線粒體內膜轉移到膜外。呼吸鏈復合物Ⅲ含有11個亞單位，1個由mtDNA編碼，10個由nDNA編碼，而線粒體細胞色素b（mitochondria cytochrome b，MT-CYB）是呼吸鏈復合物Ⅲ中唯一由mtDNA編碼的亞基，是一種高度保守的疏水蛋白，含有2個血紅素基團和8或9個跨膜區，MT-CYB與核心蛋白Ⅰ、Ⅱ共同構成呼吸鏈復合物Ⅲ的中心成分［31］。因此，MT-CYB基因的突變或缺失將直接影響線粒體氧化磷酸化的過程。本組病例中3093 C＞G、3697 G＞A和15242 G＞A突變所致的MELAS綜合征是國內首次報道，國外關于這3個位點的突變也僅有少量報道，因此，這3個突變在國內人群中導致的MELAS綜合征的臨床癥狀與突變率的關系無法考證，需要更多的病例積累，具體的發病機制有待進一步研究。

本研究中30例患者發生3243 A＞G突變，血液檢出25例發生3243 A＞G突變，突變率22.15%～100%（36.26±13.38）%；尿液檢出30例發生3243 A＞G突變，突變率38.46%～100%（59.49±22.67）%；與外周血的mtDNA突變率相比，尿液細胞的突變率顯著增高（P<0.05）。目前，尿液細胞的mtDNA突變率明顯高于外周的機制并不明確，有研究認為血外周血細胞對能量需求大、分裂速度快，可能會自然選擇地淘汰mtDNA突變率高的細胞［32］。LAAT等［33］對8例3243 A＞G突變患者從剛出生時的外周血細胞到確診MELAS綜合征（相隔8～20 a）時的外周血細胞的突變率進行縱向比較發現，外周血的mtDNA突變率進行性降低，平均每年減少1.42%。有學者認為存在于生命周期短的細胞、對細胞傷害較輕的mtDNA突變，不會對細胞生存產生壓力，允許突變的mtDNA積累等［34］。尿液細胞的DNA主要來源于腎臟和輸尿管的上皮細胞，雖然上皮細胞屬于分裂旺盛的細胞，但上皮細胞耗氧量小，允許突變的mtDNA積累，因此外周血的mtDNA突變率明顯低于尿液細胞。FIN?STERER等［35］等通過對比MELAS綜合征患者血液、尿液、唾液、肌肉細胞和毛囊的mtDNA突變率發現，血液、尿液和唾液細胞的mtDNA突變率較低，肌肉細胞的突變率最高，而尿液細胞的突變率與肌肉細胞相差無幾。但肌肉取材為有創性檢查，且不適用于無癥狀親屬的篩查。由于尿液無創、容易獲得、突變率高，可作為MELAS綜合征患者及親屬基因測序首選的標本。

本研究共發現20例患者的母親、外婆、舅舅、兄弟姐妹或兒女存在相同的突變位點，父親均未發現突變位點，符合母系遺傳。由于受精卵中線粒體的只來源于卵細胞，mtDNA只能從母親傳遞給子女，然后由她的女兒傳遞給后代，mtDNA傳遞至兒子后即終止，父親不能將線粒體基因傳遞給后代，所以ME?LAS綜合征為母系遺傳。17例患者的母親或其他親屬的尿液細胞發生3243 A＞G突變位點，突變率24.34%～89.26%（45.82±14.18）%，其中15例有臨床表現，輕重不一，2例無臨床表現。閾效應和異質性可能是患者親屬發生基因突變但無臨床表現的原因。

MELAS綜合征為母系遺傳，3243 A＞G是最常見的突變位點。臨床懷疑MELAS綜合征時，可先檢測3243 A＞G、3252 A＞G、3271 T＞C、8344 A＞G和13513 G＞A等熱點突變，這樣可確診約90%的患者，當熱點突變陰性時再行mtDNA全長基因測序，若仍為陰性，必要時可進行nDNA測序，這是一種經濟、有效的方法。尿液細胞的mtDNA突變率高于外周血，可作為MELAS綜合征患者及親屬基因測序首選的標本。本研究還發現3697 G＞A、1642 G＞A和15242 G＞A突變為國內首次報道，豐富了國內ELAS綜合征線粒體基因突變的特點。MELAS綜合征的發病機制是十分復雜的，受mtDNA和nDNA兩套遺傳體系共同調控，目前國外的研究重心逐漸從單個mtDNA突變位點轉移到多個突變位點的復合突變研究，由mtDNA組到nDNA組突變的研究。隨著分子生物學技術的廣泛應用和新技術的不斷發展，許多新的突變位點、復合突變和nDNA組突變將會被發現，將有助于闡明MELAS綜合征的發病機制。對MELAS綜合征認識的深入，也為該病的診治和遺傳咨詢提供依據。