ADP-核糖基化樣因子15與過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α基因單核苷酸多態性與糖尿病腎臟疾病的相關性研究

凃影葉，張洪江，2，康淳，杜飛，2，崔佳慧，邵薇，2，袁志敏，王偉杰，楊康鵑*

糖尿病腎臟疾病（diabetic kidney disease，DKD）是2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）最常見的并發癥之一，在T2DM中DKD的發生率和死亡率僅次于心臟大血管病變［1］，遺傳因素是其主要的發病機制之一。2009年RICHARDS等［2］通過全基因組關聯分析發現，ADP-核糖基化樣因子15（ADP-ribosylation factorlike 15，ARL15）基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs4311394的 G與 T2DM相 關，且攜帶G的個體與低水平血漿脂聯素相關。近年來李璦彤［3］研究發現，攜帶過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator receptor γ coactivator 1 α，PGC-1α）基因SNP rs7656250-C因子與延邊地區人群T2DM及合并大血管病變高度相關，具有顯性遺傳模式特征。

目前，關于ARL15和PGC-1α基因的rs4311394、rs7656250位點聯合作用與DKD患病關聯性研究尚未見報道。本研究將針對上述兩個基因SNP與DKD關系進行探究，旨在從基因角度分析DKD發生情況，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018—2019年于延邊大學附屬醫院和延吉市醫院確診的朝鮮族和漢族T2DM患者393例（記為T2DM組）、DKD患者90例（記為DKD組），同期選取在延邊大學附屬醫院進行單位體檢的健康人268例〔記為糖耐量正常組（NGT組）〕。受試者均來自延邊朝鮮族自治州，并在此居住10年以上；個體間無親緣關系。本研究經延邊大學倫理委員會審批，受試者均對本研究知情同意。

T2DM組納入標準［4］：空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L；排除標準：1型糖尿病、妊娠期糖尿病及特殊類型糖尿病。

DKD組納入標準：符合《糖尿病腎病防治專家共識（2014年版）》［5］中的DKD診斷標準；估計腎小球濾過率（eGFR）< 60 ml·min-1·（1.73 m2）-1。排除標準：由其他原發病變導致的腎臟損傷。

NGT組納入標準：FPG 3.9～6.1 mmol/L，血脂、肌酐（Cr）均在參考范圍。

NGT組中漢族137例，朝鮮族131例；T2DM組中漢族205例，朝鮮族188例；DKD組中漢族55例，朝鮮族35例。

1.2 生理、生化指標采集方法 受試者均在空腹、凈重狀態下測量身高（cm）、體質量（kg）、腰圍（cm）、臀圍（cm），計算并記錄其體質指數（BMI）及腰臀比（WHR）。

取受試者清晨空腹靜脈血2 ml，1 609×g離心10 min 10 s分離血清，采用全自動生化分析儀檢測FPG、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、Cr、尿素氮（BUN）及尿酸（UA）；采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清ARL15、脂聯素蛋白水平。

鑒于PGC-1α蛋白含量在不同組織器官中的表達差異較大，且外周血中PGC-1α蛋白含量的干擾因素較多，無法精準控制變量，因此未對PGC-1α蛋白水平進行檢測［6-7］。

1.3 DNA的提取 采用EDTA抗凝管收集外周血2 ml用于基因檢測，操作流程嚴格按照AxyGene小量全血基因組DNA提取試劑盒使用說明進行，詳細提取流程參考本課題組前期研究［3］。隨后進行1%瓊脂糖電泳，并對DNA濃度及純度進行測定。

2 結果

2.1 DNA提取結果 加樣電泳后的膠膜在紫外分光光度計下有熒光條帶顯示，表明DNA提取有效。

2.2 PCR結果 圖1為ARL15基因rs4311394位點的4個樣品，PCR擴增產物的長度為91 bp；圖2為PGC-1α基因rs7656250位點的4個樣品，PCR擴增產物的長度為75 bp。

圖1 rs4311394 PCR擴增產物結果Figure 1 The amplification product result of rs4311394

圖2 rs7656250 PCR擴增產物結果Figure 2 The amplification product result of rs7656250

2.3 測序結果 751例研究對象DNA測序結果：ARL15基因rs4311394位點和PGC-1α基因rs7656250位點測序結果見圖3～4，其中rs4311394位點測序結果采用的是其互補鏈，測序圖中野生型位點T對應為統計結果中的A，突變型位點C對應為統計結果中的G。

圖3 ARL15基因rs4311394位點測序圖Figure 3 Sequence map of the SNP rs4311394 of ARL15 gene

圖4 PGC-1α基因rs7656250位點測序圖Figure 4 Sequence map of the SNP rs7656250 of PGC-1α

2.4 等位基因頻率、基因型頻率分析

2.4.1 NGT組漢族和朝鮮族人群ARL15基因rs4311394位點、PGC-1α基因rs7656250位點等位基因頻率、基因型頻率分析 NGT組人群3種基因型分布經卡方檢驗符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P>0.05），具有群體代表性。

NGT組漢族和朝鮮族人群ARL15基因rs4311394位點、PGC-1α基因rs7656250位點等位基因頻率、基因型頻率比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1～2。

表1 NGT組漢族和朝鮮族人群ARL15基因rs4311394位點等位基因頻率、基因型頻率比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of allele and genotype frequencies of rs4311394 in ARL15 in Yanbian Korean and Han individuals in NGT group

表2 NGT組漢族和朝鮮族人群PGC-1α基因rs7656250位點等位基因頻率、基因型頻率比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of allele and genotype frequencies of rs7656250 in PGC -1α in Yanbian Korean and Han individuals in NGT group

2.4.2 三組ARL15基因rs4311394位點、PGC-1α基因rs7656250位點等位基因頻率、基因型頻率比較 三組ARL15基因rs4311394位點、PGC-1α基因rs7656250位點基因型頻率比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表3～4。

表3 三組ARL15基因rs4311394位點等位基因頻率、基因型頻率比較〔n（%）〕Table 3 Comparison of allele and genotype frequencies of rs4311394 in ARL15 in three groups

表4 三組PGC-1α基因rs7656250位點等位基因頻率、基因型頻率比較〔n（%）〕Table 4 Comparison of allele and genotype frequencies of rs7656250 in PGC -1α in three groups

2.4.3 三組ARL15、PGC-1α基因聯合位點等位基因頻率、基因型頻率比較 三組ARL15、PGC-1α基因聯合位點等位基因頻率、基因型頻率比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表5。

表5 三組ARL15、PGC-1α聯合基因型與疾病的關聯分析〔n（%）〕Table 5 Association analysis of two SNPs combined genotypes of ARL15 and PGC-1α and diseases in three groups

2.4.4 受試者ARL15基因rs4311394位點、PGC-1α基因rs7656250位點基因型與生理、生化指標的關聯分析PGC-1α基因rs7656250位點不同基因型者FPG、脂聯素水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其中攜帶PGC-1α基因rs7656250位點CT基因型受試者FPG水平高于CC、TT基因型受試者，差異有統計學意義（P<0.05）；攜帶PGC-1α基因rs7656250位點CT、TT基因型受試者脂聯素低于CC基因型受試者，TT基因型受試者脂聯素低于CT基因型受試者，差異有統計學意義（P<0.05），見表6～7。

表6 受試者ARL15基因rs4311394位點基因型與生理、生化指標的關聯分析〔M（P25，P75）〕Table 6 Association analysis of the genotype of rs4311394 in ARL15 with physiological and biochemical indices

表7 受試者PGC-1α基因rs7656250位點基因型與生理、生化指標的關聯分析Table 7 Association analysis of the genotype of rs7656250 in PGC -1α with physiological and biochemical indices

2.5 三組ARL15、脂聯素比較 三組ARL15、脂聯素比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其中T2DM組患者脂聯素低于NGT組，差異有統計學意義（P<0.05）；DKD組患者ARL15、脂聯素高于NGT組、T2DM組，差異有統計學意義（P<0.05），見表8。

表8 三組ARL15、脂聯素比較〔M（P25，P75）〕Table 8 Comparison of levels of ARL15 and adiponectin in three groups

2.6 DKD組患者ARL15與生化指標的相關性分析Spearman秩相關分析結果顯示，ARL15與BMI、WHR、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Cr、BUN、UA無相關關系，與脂聯素呈正相關（P<0.05），見表9。

表9 DKD組患者ARL15與生化指標的相關性分析Table 9 Association analysis between ARL15 and biochemical indices in DKD group

3 討論

T2DM是一種以體內糖、脂代謝紊亂為特征的代謝性疾病，體內長期高血糖、胰島素抵抗以及血脂異常是其一系列并發癥出現的主要原因［8］。近年來，盡管系統性降壓和降糖治療使得包括心血管疾病及糖尿病足在內的T2DM并發癥減少了60%～70%，但DKD的發病率依然居高不下，成為T2DM患者主要的死亡原因之一［9］。DKD早期，高血糖導致腎小球高濾過、腎小球系膜擴張、蛋白尿及腎小球毛細血管基膜增厚，隨著病程進展，腎小球濾過率降低，腎小球及腎小管間質纖維化，最終導致腎衰竭。目前，對于DKD發病機制的研究尚不完全，主要認為高血糖可通過多種途徑參與DKD的發生發展，包括異常代謝、血管生成素的過度表達、糖基化終末產物的生成等［10］。

CUI等［11］研究結果顯示，中國延邊地區朝鮮族人群中ARL15基因rs26770位點的GG基因型與T2DM患病高度相關。GAYATHRI等［12］研究結果顯示，PGC-1α基因Gly482Ser多態性與亞洲印度人罹患DKD相關。既往研究還顯示，ARL15和PGC-1α的聯合作用與血漿中脂聯素水平密切相關［3］，而脂聯素與T2DM及DKD的發生發展密切相關［13］。因此，筆者推斷ARL15和PGC-1α的聯合作用與DKD的發生之間可能存在相關性，且多位學者發現在非洲西部、亞洲地區人群以及非裔美國人體內血漿脂聯素水平與腎臟功能存在關聯性［14-16］，為本研究設計提供了理論依據。

本研究結果顯示，NGT組漢族和朝鮮族人群ARL15基因rs4311394位點、PGC-1α基因rs7656250位點等位基因頻率、基因型頻率之間差異無統計學意義，認為可能與延邊地區朝鮮族與漢族人群通婚現象比較普遍，且未將家族譜系列入篩選指標，故在后續研究中將朝鮮族與漢族人群進行合并分析，將疾病情況作為主要分組依據。本研究結果還顯示，三組ARL15基因rs4311394位點、PGC-1α基因rs7656250位點的等位基因頻率與基因型頻率差異無統計學意義，且上述兩個位點的聯合基因型在三組間差異無統計學意義，表明ARL15基因rs4311394位點與PGC-1α基因rs7656250位點并不是導致DKD與T2DM患者發病的直接因素。

在T2DM及DKD患者體內，血糖、血脂異常同時存在，有研究表明，在高糖環境中PGC-1α水平明顯下降，與腎皮質線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增加、蛋白尿增多、腎小球硬化及系膜增生呈相關性［17］。同時，體內低水平的PGC-1α還可使蛋白-線粒體分裂蛋白（DRP-1）表達增加，導致線粒體的重構，并與TG、TC升高相互促進，進一步加重腎臟病變。近期研究發現，提高PGC-1α的活性是治療急性腎損傷和慢性腎臟疾病的有力措施之一［18］。

IWABU等［19］研究發現，在肥胖情況下，PGC-1α的表達下降與脂聯素及其受體水平的降低、線粒體功能失調存在因果關系。本研究結果顯示，NGT組漢族和朝鮮族人群ARL15基因rs4311394位點、PGC-1α基因rs7656250位點等位基因頻率、基因型頻率比較，差異無統計學意義；而攜帶PGC-1α基因rs7656250位點CT基因型受試者FPG水平高于CC、TT基因型受試者；攜帶PGC-1α基因rs7656250位點CT、TT基因型受試者脂聯素低于CC基因型受試者，TT基因型受試者脂聯素低于CT基因型受試者。有研究表明，脂聯素水平與血糖值呈負相關［3］，T2DM與DKD患者體內脂聯素水平降低，脂肪細胞的分泌與血糖水平增高，而體內糖、脂代謝紊亂是DKD發病機制的關鍵一環，提示PGC-1α基因rs7656250-T可能為T2DM和DKD患者發病的影響因素之一。

本研究結果顯示，T2DM組脂聯素低于NGT組；DKD組ARL15、 脂 聯 素 高 于NGT組、T2DM組；Spearman秩相關分析結果顯示，ARL15與脂聯素呈正相關。NANAYAKKARA等［20］研究結果也證實了，在慢性腎臟病患者中脂聯素水平與eGFR之間存在負相關，而PALMER等［22］研究結果顯示，腎功能下降率（即eGFR的斜率）與包括腎小球硬化和系膜溶解在內的腎小球病變高度相關。一項最近的研究結果顯示，40%～50%的DKD患者在沒有出現蛋白尿的情況下出現了eGFR的降低，表明在DKD的發生發展中，eGFR可能是一個更為敏感的臨床指標［22］。當DKD患者體內血清脂聯素水平上調時，eGFR呈下降的趨勢，表現為腎臟功能的減退。

本研究尚存在一定的局限性。首先，在研究對象方面，由于臨床數據的不足，樣本的生理、生化指標采集并不充分，且在以民族為分組的分析中未將家系作為排除指標，這可能是導致ARL15基因rs4311394位點與PGC-1α基因rs7656250位點在延邊地區朝鮮族與漢族中差異無統計學意義的原因之一。其次，由于PGC-1α蛋白的特殊性，本研究未對其進行檢測，下一步本課題組將繼續查閱文獻，以期在后期試驗中可以加入這項指標。

綜上所述，本研究雖然未發現ARL15、PGC-1α基因SNP與T2DM、DKD的相關關系，但一定程度上證明了攜帶PGC-1α基因rs7656250位點的CT、TT基因型人群體內脂聯素水平明顯降低，推測rs7656250-T可能為T2DM和DKD患病的影響因素，為T2DM及DKD的遺傳易感性提供一定的遺傳學理論依據。

作者貢獻：凃影葉主要負責研究方案的設計、全程參與實驗的操作、最終數據統計及論文的撰寫；張洪江協助進行相關實驗，處理數據；康淳、杜飛、崔佳慧、邵薇和袁志敏協助數據收集，進行論文的校正，英文的修訂；王偉杰和楊康鵑對文章的可行性進行分析，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。

本研究鏈接：

近年來，隨著糖尿病確診人數的逐年攀升，糖尿病腎臟疾病（DKD）的發病率也從25.4%上升到27.1%，是1型糖尿病的主要死因，而在2型糖尿病中DKD的發生率和死亡率也僅次于心臟大血管病變。DKD作為一種由長時間高血糖、胰島素抵抗和血脂紊亂而引發的腎臟微血管病變，病變初期，體內長期高血糖導致腎小球高濾過，腎小球入球小動脈擴張。隨著病程進展，逐漸出現腎小球毛細血管基底膜的增厚以及腎間質的纖維化，最終導致終末期腎衰竭的發生。根據目前的研究，DKD的發病機制非常復雜，主要與糖代謝紊亂、血流動力學異常、炎性反應、氧化應激及遺傳因素相關，由于DKD是一種多基因遺傳病，故遺傳因素在DKD的遺傳易感性上起重要作用。