胃癌患者血清miR-181b和PDCD4水平表達與幽門螺桿菌感染的關系

饒向東，劉振宇，湯紅亮，張 慧，白 雪，項夢琦，謝瑞霞，徐 龍

（1.湖北省孝昌縣第一人民醫院消化內科，湖北孝感 432900;2.深圳大學總醫院消化內科，深圳大學臨床科學研究院，深圳大學國際腫瘤中心，廣東深圳 518055）

胃癌是我國常見的起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，胃癌可發病于胃竇部、胃大、小彎等處，早期胃癌表現不明顯，易錯過最佳治療期，晚期胃癌患者常有腹痛、貧血、消瘦、嘔血等臨床表現，生存率較低，對患者的生活質量及生命安全造成較大影響[1]。胃癌病情發展復雜，與遺傳因素、個體因素、環境因素等多種因素均密切相關[2]，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種微厭氧的螺旋形病菌，是胃癌、胃炎等消化系統疾病的主要感染菌，患者感染Hp 后，Hp相關的細胞毒素、酶類、細胞因子等均參與機體的不良反應，對胃黏膜病變、消化道潰瘍、胃癌、胃炎等疾病的發生產生不利影響[3-4]。微小RNA是近年來發現的參與細胞增殖、腫瘤發生及轉移等多種生理活動的非編碼單鏈RNA，具有促進或抑制腫瘤發生等作用，miR-181 家族在人體細胞中廣泛存在，miR-181b 是其中之一，與多種腫瘤疾病密切相關[5]。程序性細胞死亡因子4（programmed cell death factor 4，PDCD4）是近年來發現的抑癌基因，通過抑制細胞腫瘤性轉化發揮腫瘤抑制作用，在胃癌組織中呈現低表達，與胃癌的發生發展密切相關[6]。本研究通過測定胃癌患者血清中miR-181b，PDCD4 表達情況，分析二者與胃癌患者Hp 感染情況之間的關系，為臨床診治胃癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年12月～2019年12月湖北省孝昌縣第一人民醫院收治的胃癌患者82例為胃癌組，其中男性42 例，女性40 例，年齡42～79 歲，平均年齡56.71±7.39 歲。同期選取本院健康體檢者91 例為對照組，其中男性46 例，女性45 例，年齡40～81 歲，平均年齡58.38±8.16 歲，兩組研究對象年齡、性別差異無統計學意義。納入標準：①診斷標準參考《胃癌診斷標準》[7]；②首次確診為胃癌；③未進行生物治療、放療及化療等。排除標準：①伴有其他部位惡性腫瘤患者；②伴有嚴重心、肺、肝功能不全者；③伴有嚴重血液疾病及免疫系統疾病等；④近6 個月服用抗生素、抗炎、胃黏膜保護類藥物等。本研究經醫院道德倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 儀器與試劑 RNA 提取試劑盒購于美國Invitrogen 公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 購于日本TAKARA 公司；miScript SYBR?Green qPCR Kit 購于德國QIAGEN 公司；引物，由上海生工生物工程有限公司合成；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀、全自動生化分析儀購于美國Bio-Rad 公司；13C 呼氣試驗紅外光譜儀購于安徽養和醫療器械設備有限公司；光學顯微鏡購于上海兆儀光電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Hp 感染檢測：采用13C 呼氣試驗[8]測定對照組及胃癌組受試者的Hp 感染情況，受試者空腹服用13C 尿素膠囊后30 min 通過紅外光譜儀進行呼氣，呼出氣中13C 原子峰大于基線5% 記為Hp 感染陽性。

1.3.2 Hp 感染密度檢測：參考文獻[9]，采集胃癌組患者距離幽門2.5 cm 處的胃黏膜組織適量，光學顯微鏡中進行病理診斷，在油鏡下分析Hp感染密度，Hp 輕度：樣本中Hp 小于1/3；Hp 中度：樣本中Hp 超過1/3 但小于2/3；Hp 重度：樣本中Hp 成堆存在。對照組不進行鏡檢。

1.3.3 血清標本采集：采集對照組及胃癌組受試者空腹靜脈血5～6 ml，室溫靜置20 min，4℃下3 000×g 離心10 min，采集血清至RNA 酶離心管中，-80℃冰箱保存備用，用于后續RNA的提取。

1.3.4 qRT-PCR 法測定受試者血清中miR-181b，PDCD4 的表達水平：利用RNA 提取試劑盒（Invitrogen 公司）提取血清總RNA，經過反轉錄得到cDNA，采用實時熒光定量PCR 法（qRT-PCR）對miR-181b，PDCD4 進行擴增。qRT-PCR 反應體系共20μl：miScript SYBR?Green Mix 10 μl，cDNA（50ng/μl）2μl，上下游引物（10μmol/L）各1μl，ddH2O 6.0μl。反應條件：95 ℃90s；95 ℃30s；62 ℃30s；72 ℃15s；共40 個循環。miR-181b，PDCD4 及內參U6，GAPDH 的引物序列見表1。采用2-??Ct法對血清miR-181b，PDCD4 相對表達水平進行分析。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.4 統計學分析 采用軟件SPSS 25.0 統計學分析。以均數±標準差（±s）對計量資料進行表述，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗；計數資料用n進行描述，行χ2檢驗；Spearman 法分析miR-181b,PDCD4 與胃癌Hp 感染的相關性。

2 結果

2.1 Hp 感染檢測 對照組中79 例為Hp 感染陰性，12 例為Hp 感染陽性，Hp 感染陽性率為13.19%；胃癌組19 例為Hp 感染陰性，63 例為Hp 感染陽性，Hp 感染陽性率為76.83%；與對照組相比，胃癌組Hp 感染陽性率顯著升高, 差異有統計學意義（χ2=68.571，P＜0.05）。

2.2 對照組與胃癌組血清中miR-181b，PDCD4 表達水平比較 見表2。與對照組相比，胃癌組Hp陰性、Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平均顯著升高（t=13.779，8.158，均P＜0.05），PDCD4 表達水平均顯著降低（t=8.432，19.087，均P＜0.05），且胃癌組及對照組Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平高于Hp 陰性患者（t=3.469，4.163，均P＜0.05），PDCD4 表達水平低于Hp 陰性患者（t=8.878，16.470，均P＜0.05），差異均有統計學意義。

表2 兩組受試者血清中miR-181b，PDCD4 表達水平比較（±s）

表2 兩組受試者血清中miR-181b，PDCD4 表達水平比較（±s）

項 目對照組胃癌組tP Hp 陰性miR-181b0.98±0.191.67±0.2213.7790.000 PDCD41.06±0.180.69±0.138.4320.000 Hp 陽性miR-181b1.19±0.232.28±0.458.1580.000 PDCD40.76±0.110.34±0.0619.0870.000

2.3 不同Hp 感染密度與血清中miR-181b，PDCD4 表達水平比較 見表3。隨著胃癌患者Hp感染密度的增加，Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平呈依次升高趨勢（t=5.476，7.479，2.227，均P＜0.05），PDCD4 表達水平均呈依次降低趨勢（t=10.216，14.014，9.199，均P＜0.05）。

表3 不同Hp 感染程度的胃癌患者血清中miR-181b，PDCD4 表達水平比較（±s）

表3 不同Hp 感染程度的胃癌患者血清中miR-181b，PDCD4 表達水平比較（±s）

注：中度組與輕度組相比，miR-181b/U6：t=5.476，P=0.000，PDCD4/GAPDH：t=10.216，P=0.000；重度組與中度組相比：miR-181b/U6：t=2.227，P=0.034，PDCD4/GAPDH：t=9.199，P=0.000；重度組與輕度組相比：miR-181b/U6：t=7.479，P=0.000，PDCD4/GAPDH：t=14.014，P=0.000。

項 目Hp 密度F P輕度（n=32）中度（n=19）重度（n=12）miR-181b/U61.87±0.372.54±0.502.98±0.598.8750.000 PDCD4/GAPDH0.48±0.090.25±0.050.11±0.0239.6440.000

2.4 胃癌患者Hp 感染與血清miR-181b，PDCD4表達水平相關性分析 Spearman 相關性分析結果顯示血清中miR-181b 水平與胃癌患者Hp 感染呈正相關性，與Hp 陽性相關系數為0.659，與Hp 陰性相關系數為0.685（P＜0.001），血清中PDCD4 水平與胃癌患者Hp 感染呈負相關性，與Hp 陽性相關系數為-0.611，與Hp 陰性相關系數為-0.702（P＜0.001）。

3 討論

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，隨著現代飲食結構及生活方式的改變以及環境污染加重、農藥、化肥等藥品的大量使用，造成胃癌發病率逐年升高，胃癌患者常會有上腹疼痛、進行性吞咽困難、嘔血、黑便等不良表現，對患者的身體、心理健康及生活質量造成較大的影響[10]。引起胃癌發生的原因多樣，Hp 感染是引發胃癌的重要危險因素，資料顯示Hp具有調控細胞生長和分化的作用，進而引發機體的炎癥反應，加劇胃黏膜損傷，從而引起癌變[11]。本研究結果顯示，胃癌組Hp 感染陽性率顯著高于健康體檢者，提示胃癌患者中具有較高的Hp 感染陽性率，表明Hp 感染與胃癌發生密切相關，Hp 常存在于胃竇部、胃小凹等胃癌常發部位，這些部位長期受到Hp 的感染，引發癌變的幾率會大大增加[12]。

miRNA 為一類具有多種生物學功能的進化保守的短序列小RNA，主要通過調節相關基因的表達作為抑癌基因或原癌基因參與機體腫瘤的發生與發展，諸多研究表明miRNA 異常表達與胃癌的發生發展聯系密切[13]，資料顯示miR-181 家族在胃癌、肝癌、肺癌等腫瘤的形成發展中起到重要作用，miR-181b 是其中一員，miR-181b 在胃癌組織中呈現高表達，高表達的miR-181b 對于胃癌患者的生存具有不利影響[14]。本研究結果顯示，胃癌組Hp陰性、Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平均顯著高于對照組，且胃癌組及對照組Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平高于Hp 陰性患者，提示miR-181b 可能參與了胃癌疾病的進展。

PDCD4 是近年來發現的一種腫瘤抑制基因，與胃癌、結腸癌等多種腫瘤的侵襲、轉移密切相關，其在胃癌中的具體機制尚不清晰[15]。研究發現PDCD4 在胃癌患者血清中呈現低表達，且與患者的不良飲食習慣呈現相關性[16]。LI 等[17]人研究發現在高表達的miR-183 通過抑制PDCD4 的表達來促進胃癌細胞的增殖、轉移等。本研究結果顯示，胃癌組Hp 陰性、Hp 陽性患者血清中PDCD4 表達水平均顯著低于對照組，且胃癌組及對照組Hp 陽性患者血清中PDCD4 表達水平低于Hp 陰性患者，與miR-181b 表達水平呈現相反趨勢，提示PDCD4低表達可能對于胃癌疾病具有不利影響，提示miR-181b 與PDCD4 具有一定的負向調控關系，表明miR-181b 可能通過靶向PDCD4 來發揮促癌作用；隨著胃癌患者Hp 感染密度的增加，Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平呈依次升高趨勢，PDCD4表達水平均呈依次降低趨勢，Spearman 相關性分析結果顯示血清中miR-181b 與胃癌患者Hp 感染呈正相關性，血清中PDCD4 與胃癌患者Hp 感染呈負相關性，表明Hp 感染可能具有一定影響miR-181b，PDCD4 表達水平的作用，可能共同參與了胃癌的發生。

胃癌的發生與多種因素相關，其發生機制復雜。本研究通過測定胃癌患者的Hp 感染情況及血清中miR-181b，PDCD4 的表達水平，發現Hp 感染程度的加深與miR-181b 表達水平的升高及PDCD4 表達水平的降低密切相關，三者的異常表達均參與了胃癌的發生及發展，但其中的潛在機制尚不清晰，仍需進一步研究。