人工遠端肢體缺血再灌注對APAP誘導小鼠肝損傷的保護作用研究

鄭 偉，宋曉雪，嚴 翔，張智勇，常虎林

（陜西省人民醫院肝膽外科，西安 710068）

對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）誘導的急性肝損傷是藥物誘導的肝損傷及肝衰竭的主要原因[1]。目前對早期藥物性肝損傷的治療主要是服用解毒藥N-乙酰半胱氨酸（NAC），病人如果不及時接受NAC 治療則會導致嚴重的肝損傷，從而進一步發展成肝衰竭遠端肢體缺血再灌注處理是近年來研究發現的能有效抵抗缺血再灌注損傷從而對心臟和肝臟起到保護作用的一種方法[3-4]。根據其在靶器官缺血前還是缺血后處理分為遠端肢體缺血再灌注預處理（R-IPC）和遠端肢體缺血再灌注后處理（R-IPOST）。基于R-IPC 和R-IPOST 對遠端器官缺血再灌注損傷具有一定的保護作用[5]，本研究旨在探究R-IPC 和R-IPOST 在APAP 誘導的藥物性肝損傷中的作用研究, 擬為急性藥物性肝損傷的治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 4～5 周齡、體重約20～26 g 的雄性C57BL/6 小鼠購買自陜西省人民醫院實驗動物中心[許可證號：SYXK（陜）2016-006]，并在該中心飼養。小鼠的飼養及監管嚴格按照陜西省人民醫院倫理委員會規則執行。

1.2 儀器及試劑 TNF-α 和IL-6 檢測試劑盒由深圳達科為生物技術有限公司提供。ALT 試劑盒、AST 試劑盒、GSH 試劑盒、SOD 試劑盒和MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。RIPA裂解液由上海碧云天生物技術有限公司提供。APAP 溶液的配制（將0.6g APAP 粉劑溶于100ml生理鹽水中，在40℃水浴鍋中晃動充分溶解、混勻，按300mg/kg 即50ml/kg 的劑量給藥準備，每只小鼠約20g 重，平均給藥劑量約1ml）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及模型制作：實驗分組：①正常對照組：小鼠不做任何處理；②假手術組：小鼠遠端缺血預處理后腹腔注射1ml 生理鹽水；③APAP 組：小鼠腹腔注射1ml APAP 的生理鹽水溶液；④R-IPC+APAP 組：小鼠遠端缺血處理后 5min 后腹腔注射1ml APAP 的生理鹽水溶液；⑤R-IPOST+APAP 組：小鼠腹腔注射1ml APAP 的生理鹽水溶液后，進行遠端缺血處理。各組小鼠均在APAP 暴露16 h 后處死，及時采集血液樣本和肝組織樣本。

遠端肢體缺血再灌注處理：首先麻醉小鼠：將 25 mg 的氯胺酮和2.5 ml 甲苯噻嗪混合比例配制好麻藥，給每只小鼠注射麻藥，麻藥的給藥劑量為3～5 ml/kg；在雙側后肢股三角處剪毛，沿血管走行方向逐層切開皮膚、皮下組織，分離縫匠肌后部，游離出雙側股動脈待用。R-IPC 組用無損傷小血管夾夾閉雙側股動脈5 min 造成肢體缺血后，再松開血管夾，讓血液再灌注5min,連續操作4 個循環，再腹腔注射1ml 的APAP 鹽溶液（300 mg/kg 溶解于1ml 生理鹽水中）。R-IPOST 是先腹腔注射1ml的APAP 鹽溶液后，再進行4 個周期的肢體遠端缺血再灌注。可通過足部的顏色及雙下肢股動脈搏動情況來顯示血液流動情況進而評價遠端局部缺血的效果。

1.3.2 血清ALT, AST, TNF-α, IL-6 水平的測定：根據檢測試劑盒說明書指示，測定血清ALT, AST,TNF-α, IL-6 水平。

1.3.3 肝組織病理學檢查 ：取出分離后的肝臟組織利用甲醛溶液固定, 常規蘇木精-伊紅（H＆E）染色,觀察肝組織病理學改變。

1.3.4 氧化應激程度的測定：根據檢測試劑盒說明書指示，測定肝組織MDA, GSH, SOD 含量。

1.4 統計學分析 GraphPad Prism6.0 對數據進行統計學分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）形式表示。多組的比較采用單因素方差分析,進一步組間比較采用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 R-IPC 和 R-IPOST 對APAP 肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 見圖1。與對照組和假手術組比較，APAP 組炎性細胞浸潤，肝竇擁擠出血，肝小葉中心廣泛壞死，肝小葉結構破壞明顯；與APAP組比較，可見R-IPC+APAP 組和 R-IPOST+APAP組小鼠肝臟肝細胞壞死減少，肝竇無明顯擁擠現象，肝小葉中心未出現廣泛壞死。2.2 R-IPC 和R-IPOST 處理對APAP 肝損傷小鼠肝功能、炎癥水平和氧化應激程度的影響 見表1。與對照組和假手術組ALT, AST 水平相比，APAP組小鼠血清中ALT, AST 水平明顯升高，差異均有統計學意義（t=12.520～19.730, 均P<0.05），提示小鼠藥物性肝損傷造模成功。R-IPC+APAP 組血清ALT, AST 水平明顯低于APAP 組，差異有統計學意義(t＝7.032, 3.432, 均P<0.05)。R-IPOST+APAP組血清ALT, AST 明顯低于APAP 組，差異均有統計學意義(t＝4.981, 3.470，均P<0.05)。ALT, AST在R-IPC+APAP 組與R-IPOST+APAP 組間差異無統計學意義（t＝0.860, 0.231,P＞0.05)。

表1 遠端缺血再灌注對APAP 誘導急性藥物性肝損傷小鼠各指標的影響（±s）

表1 遠端缺血再灌注對APAP 誘導急性藥物性肝損傷小鼠各指標的影響（±s）

項 目正常對照組假手術組APAP 組R-IPC+APAP 組R-IPOST+APAP 組ALT(U/L)38.8±4.438.6±3.85 564± 621.73 742±519.73 410± 588.6 AST(U/L)28.6±3.527.8±4.24 647± 813.93 471± 631.43 546±499.5 TNF-α(pg/ml)45.0±5.247.2±4.2351.7 ± 52.3264.8± 70.4256.6± 48.1 IL-6(pg/ml)72.0±6.976.0±7.1929.7± 140.6738.7 ± 71.0775.4 ± 98.4 MDA (nmol/mg.prot)2.6±0.82.8±1.013.1± 1.78.9± 1.29.3 ±1.9 SOD(U/mg.prot)18.1±1.518.4±1.28.6± 1.111.0± 1.910.3± 1.6 GSH(U/mg.prot)14.2±1.014.6±2.57.9± 0.6 8.7±1.2 10.3±1.2

圖1 R-IPC 和 R-IPOST 處理對APAP 誘導的肝組織的病理學變化的影響(HE 染色)

與對照組和假手術組比較，APAP 組小鼠血清TNF-α, IL-6 水平明顯升高，差異有統計學意義（t＝12.150～14.310, 均P<0.05）。R-IPC+APAP組血清TNF-a, IL-6 水平明顯低于APAP 組，差異均有統計學意義(t＝3.400, 3.602，均P<0.05)。R-IPOST+APAP 組血清TNF-a, IL-6 水平明顯低于APAP 組，差異均有統計學意義(t＝2.924, 2.196，均P<0.05)。TNF-α, IL-6 在R-IPC+APAP 組 與R-IPOST+APAP 組間差異無統計學意義（t＝0.162,0.660,P＞0.05)。

與對照組和假手術組比較，APAP 組小鼠MDA含量明顯增多，差異有統計學意義（t＝16.090,14.150,P<0.05）。R-IPC+APAP 組和R-IPOST+APAP組肝組織MDA 含量明顯低于APAP 組，差異均有統計學意義(t＝3.483, 4.581，均P<0.05)。MDA在R-IPC+APAP 組與R-IPOST+APAP 組間差異無統計學意義（t＝0.347,P＞0.05)。

與對照組和假手術組比較，APAP 組小鼠SOD 及 GSH 活性均明顯下降，差異均有統計學意義（t＝5.748～12.460, 均P<0.05）。R-IPC+APAP組SOD 明顯高于APAP 組，差異有統計學意義（t＝3.043，P<0.05）；GSH 活性高于APAP 組，但差異無統計學意義（t＝1.622，P=0.18）。R-IPOST+APAP 組SOD 高于APAP 組，但差異無統計學意義（t＝1.940，P=0.12）；GSH活性明顯高于APAP 組，差異有統計學意義（t＝3.702，P<0.05）。SOD, GSH 在R-IPC+APAP組與R-IPOST+APAP 組間差異無統計學意義（t＝0.488, 1.685, 均P＞0.05)。

3 討論

肝臟是人體主要的代謝器官，其主要參與體內糖原儲存，分解血液中的紅細胞、蛋白合成以及解毒過程等功能[6-7]。由于其多方面生理功能導致其是許多藥物毒性作用的靶器官[8]。APAP 在治療劑量時是一種解熱鎮痛消炎藥且具有安全性。但是過量時會使肝小葉中心的肝細胞發生壞死，嚴重時可致命。

遠端局部缺血因其使用便捷成為臨床中最具潛力的一種治療手段[9]。組織的短暫缺血比如遠端肢體缺血再灌注預處理和后處理，能對靶器官產生保護作用，使其免受缺血或其他損傷[10]。而遠端肢體缺血再灌注預處理和后處理僅在干預時機上有差別，本次研究發現兩種處理方式組間結果差異無統計學意義，都能降低APAP 誘導的肝臟損傷程度，減少炎癥反應和氧化應激程度，起到相近的保肝作用。

炎癥反應在APAP 誘導的肝毒性的機制中發揮著重要作用。既往研究發現APAP 處理能刺激機體分泌炎性因子，比如TNF-α, IL-1β 和IL-6 等，表明這些細胞因子在APAP 誘導的毒性作用中發揮潛在作用[11]。BLAZKA 等[12]人證明小鼠經過APAP 處理后TNF-α 的血清水平明顯增加，使用TNF-α 抗體能夠抵抗APAP 誘導的毒性作用。以往的研究表明遠端缺血后處理對肝缺血/再灌注損傷或脂多糖誘導的肝損傷產生的炎性反應具有降低的效應[3-4]。本次研究結果表明R-IPC 和 R-IPOST能降低APAP 誘導肝損傷TNF-α 和IL-6 水平，具有抗炎作用。

氧化應激是APAP 誘導肝損傷的另一個重要原因。MDA 是脂質過氧化的代謝產物，其含量反映了機體的脂質過氧化程度[13]。而GSH，SOD 則是體內最重要的抗氧化物質，也是中和APAP 所致毒性的關鍵[14-15]。近年來，COSTA 等[16]人發現遠端缺血預處理能抵抗肝臟和腎臟細胞的氧化性損傷。XIN 等[17]人也發現遠端缺血后處理能降低非酒精性脂肪肝大鼠MDA 和SOD 的水平。本研究顯示R-IPC 和R-IPOST 同樣能夠抑制APAP 誘導的氧化應激、改善氧化損傷，改善GSH 和SOD 水平，降低MDA 產生。

目前有報道稱R-IPC 能減輕非酒精性脂肪肝大鼠遭受缺血再灌注損傷，其機制可能與誘導合成熱休克蛋白 70（HSP70）的表達有關[18]。SHIN 等[19]人發現NF-κB 是遠端局部缺血條件作用的一個靶點，NF-κB 的激活和核內轉錄可以被HO-1 抑制，從而發揮對脂肪肝細胞的保護作用。盡管如此，對于遠端缺血處理降低肝臟再灌注或炎性損傷的機制仍未完全明確。

綜上所述，R-IPC 和R-IPOST 能降低APAP 誘導肝損傷的炎癥反應及氧化應激程度，對藥物性肝損傷具有保護作用。本研究僅對遠端肢體缺血再灌注處理對APAP 誘導肝損傷的保護作用進行初步觀察，而涉及其中的分子機制仍有待進一步深入研究。