胃癌組織中FOXP1和FOXQ1的表達水平與臨床病理特征及預后關系

朱 濤，王 偉，吳和剛

（1.宜賓市中醫醫院普外科,四川宜賓 644000；2.宜賓市第一人民醫院,a.普外科；b.病理科，四川宜賓 644000）

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發病率在消化道腫瘤中居首位，其病死率居于惡性腫瘤第三位，且5年生存率低于30%[1-2]。目前探究胃癌的生物學特性與復發、轉移及預后的關系，并找到相關的分子靶點予以靶向治療研究已成為當今胃癌臨床研究的熱點。叉頭框(forkhead box, FOX)蛋白作為一種轉錄調控因子，參與脂類的新陳代謝、細胞周期的調控、胚胎發育、免疫調節及生物老化等多種生物過程，其異常表達與代謝性疾病、發育畸形及腫瘤的發生發展存在密切相關[3-4]。多個FOX 家族的亞族廣泛地參與腫瘤的發生和轉移，其中叉頭框蛋白P1(forkhead box P1, FOXP1)和叉頭框蛋白Q1(forkhead box Q1, FOXQ1)屬于重要的叉頭轉錄因子[4]。研究報道，FOXP1 與FOXQ1 參與機體多種生理生化過程，在多種惡性腫瘤中異常表達[5-6]。但關于FOXP1 和FOXQ1 在胃癌中的作用研究鮮有報道。本研究采用免疫組化EnVision 法檢測胃癌組織和癌旁組織中FOXP1，FOXQ1 的表達情況，并分析兩者與臨床病理參數和預后的關系，旨在探討二者聯合檢測對胃癌預后診斷的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2014年1月～2017年2月在宜賓市中醫醫院普外科接受手術治療的156 例胃癌患者，選取胃癌組織作為觀察組，同時選取癌旁正常組織(距腫瘤邊緣＞5cm)作為對照組。納入標準：所有患者診斷均經術前影像、胃鏡檢查和術后病理證實；所有患者均行胃癌根治術；術前未接受免疫治療、放化療或靶向治療；臨床隨訪資料完整者；患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：術前接受新輔助治療者；并發有其他原發性腫瘤者；行姑息性手術者；伴發血液、內分泌、免疫系統等對腫瘤標志物檢測有影響的相關疾病；隨訪資料缺失。156例患者中男性91例，女性65例；年齡32～79歲，平均年齡55.26±8.59 歲；脈管神經侵犯67 例，未侵犯89 例；區域淋巴結轉移92 例，未轉移64 例；低分化69 例，中、高分化87 例； Lauren 分型彌漫型81 例，腸型75 例。

1.2 儀器與試劑 鼠抗人單克隆FOXP1,FOXQ1 抗體(美國Santa Cruz 公司)，免疫組化EnVision 試劑盒和DAB 顯示試劑盒（中杉金橋有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測:所有胃癌組織標本均以10g/dl 甲醛固定，石蠟包埋。免疫組化染色(EnVision二步法)：常規脫蠟水化，抗原修復，DAB 顯色，蘇木精復染，芯片脫水，透明，封固，用自身對照作陽性對照，用PBS 代替一抗作陰性對照。

1.3.2 免疫組化結果判定：FOXP1，FOXQ1 蛋白陽性顯色為淺黃色至棕黃色顆粒。FOXP1 陽性表達主要定位于細胞質和(或)細胞核，FOXQ1 陽性表達主要定位于細胞質和胞質膜。根據染色強度與染色陽性細胞百分比對檢測結果進行綜合評定。每張切片觀察5 個以上高倍視野(×400)，計數≥1 000 個細胞中的陽性細胞數，計算陽性細胞比。染色細胞百分率評分：陽性細胞率≤10%為0 分，11%～25% 為1 分，26%～50% 為2 分，5l%～75%為3分，>75%為4分；染色強度評分：淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。FOXPl 和FOXQ1蛋白的表達結果為2 項乘積，0～3 分為低或無表達，4～12 分為高表達。本研究根據FOXPl 和FOXQ1蛋白表達將標本分為高表達組和低或無表達組。

1.3.3 隨訪:采用來院就診和電話等方式對患者進行5年隨訪。隨訪截至2020年8月31日，隨訪時間為3～60 個月。隨訪內容為患者總體生存時間(overall survival time, OS)。OS 為手術開始至末次隨訪或死亡的時間。

1.4 統計學分析 所有數據采用SPSS22.0 統計軟件進行處理，計數資料以陽性率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman 相關分析胃癌組織中FOXP1 與FOXQ1 表達的相關性；采用Cox比例風險回歸模型分析胃癌患者預后的危險因素；采用Kaplan-Meier 生存法分析胃癌患者術后OS，比較采用Log-rank 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXP1，FOXQ1 蛋白在胃癌和癌旁組織中表達情況 胃癌組織中FOXPl蛋白高表達率（38.46%）低于癌旁組織（86.67%），差異有統計學意義(χ2=23.521,P＜0.05)；胃癌組織中FOXQl 蛋白高表達率(65.38%)高于癌旁組織（6.67%），差異有統計學意義(χ2=35.193,P＜0.05)。

2.2 胃癌患者FOXPl，FOXQl 蛋白表達情況與臨床病理特征的關系 見表1。胃癌組織中FOXPl，FOXQl 蛋白表達與年齡、性別、Lauren 分型、腫瘤部位無關，差異無統計學意義(均P＞0.05)；胃癌組織中FOXPl，FOXQl 蛋白表達與腫瘤大小、病理分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移、浸潤深度及脈管神經侵犯相關，差異均有統計學意義(χ2=5.668～14.909, 均P＜0.05)。

表1 FOXP1，FOXQ1 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系(%)

2.3 胃癌組織中FOXP1 和FOXQ1 蛋白的相關性分析 在156 例胃癌中，96 例FOXP1 低或無表達的胃癌組織中，FOXQ1 高表達92 例，而低或無表達僅有4 例；60 例FOXP1 高表達的胃癌組織中，FOXQ1 低或無表達的50 例，而高表達僅有10 例。經Spearman 相關性分析結果顯示，FOXP1和FOXQ1 蛋白在胃癌組織中的表達呈負相關(r=-0.526,P＜0.001)。

2.4 預后影響因素分析 見表2。將胃癌患者OS 作為因變量，以腫瘤大小、病理分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移、浸潤深度、脈管神經侵犯、FOXP1 表達、FOXQ1 表達、FOXP1低或無表達/FOXQ1高表達為自變量進行多因素Cox 回歸分析，結果顯示TNM 分期、淋巴結轉移、浸潤深度、FOXP1 低或無表達、FOXQ1 高表達、FOXP1低或無表達/FOXQ1高表達均是影響胃癌患者OS 的獨立危險因素(P＜0.05)。

表2 影響胃癌患者OS 的多因素Cox 回歸分析

2.5 生存分析 Kaplan-Meier 法分析結果顯示FOXP1 低或無表達組和高表達組5年生存率分別為50.00%，68.30%，FOXP1 低或無表達組者OS短于高表達患者(χ2=6.570,P=0.010)；FOXQ1 高表達組和低或無表達組5年生存率分別為50.98%和68.52%，FOXQ1 高表達組OS 短于低或無表達組(χ2=7.045,P=0.008)；FOXP1低或無表達/FOXQ1高表達組和其他患者5年生存率分別為32.60%和92.20%，FOXP1低或無表達/FOXQ1高表達患者OS 短于其他患者(χ2==57.228,P=0.000)；FOXP1低或無表達/FOXQ1高表達組、FOXP1 低或無表達組和FOXQ1 高表達組5年生存率分別為32.60%，50.00%，50.98%，FOXP1低或無表達/FOXQ1高表達組OS 短于FOXP1 低或表達組和FOXQ1 高表達組(χ2=8.112,P=0.017) 。

3 討論

近年來，胃癌的診斷技術水平已獲得較大進步，但因胃癌起病隱匿，早期無癥狀或癥狀不明顯，很多患者被確診時已是臨床晚期[7]。手術治療仍是當前治療胃癌的重要方法，胃癌根治術是主要的手術方式[8]。胃癌根治術盡管已進行了廣泛的淋巴結清掃，但中晚期患者術后復發率仍較高，5年生存率低于20%[9]。胃癌的發病與體內癌基因及抑癌基因表達異常造成細胞增殖異常及凋亡受到抑制有關[10]。對胃癌的生物學特性、轉移、復發及預后從基因層面上進行探索，并找到相關分子靶點予以靶向治療研究已成為當今胃癌研究的熱點。

叉頭框蛋白(forkhead box, FOX)是一個轉錄因子家族，具有進化保守的“叉頭”或“翼狀螺旋結構”的DNA 結合域，在細胞周期調控、增殖、分化及DNA 損傷反應等多種生物學過程中扮演著重要角色[11]。研究報道，FOX 家族通過復雜廣泛的網絡，在不同的調控水平上促進惡性腫瘤的發生發展[12]。叉頭框蛋白P1(FOXP1)是FOX 家族成員之一，定位于3p14.1 的腫瘤抑制基因座，此區域與許多腫瘤類型雜合性缺失相關，FOXP1 可能是一種潛在的惡性腫瘤抑制基因[13]。FOXP1 轉錄活性在許多惡性腫瘤中受到抑制，可能與FOXP1 mRNA 的下降、FOXP1 在細胞質的異常定位或表達水平下降有關[14-15]。劉湘鄂等[16]研究報道，前列腺癌組織中FOXP1 蛋白表達缺失或低表達與預后不良密切相關。孫百爾等[17]研究報道，FOXP1 蛋白在非小細胞肺癌組織中表達下降，其表達水平越低患者生存時間越短。XIAO 等[18]研究報道，子宮內膜癌組織中FOXP1 蛋白低表達，且與低氧介導因子1α，雌激素受體-α 的表達呈負相關。目前，FOXP1 在胃癌中的研究報道較少。本研究結果顯示，胃癌組織中FOXPl 蛋白高表達率低于癌旁組織(P＜0.05)；胃癌組織中FOXPl 蛋白表達與腫瘤大小、病理分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移、浸潤深度及脈管神經侵犯相關(P＜0.05)；多因素Cox 回歸分析結果顯示，FOXP1 低或無表達是影響胃癌患者OS的獨立危險因素(P＜0.05)；Kaplan-Meier 分析結果顯示，FOXP1 低或無表達組者OS 累積生存率低于高表達患者(P＜0.05)。結果表明，FOXP1 蛋白的表達在胃癌組織中被抑制，其在胃癌的發生發展中可能起到一定的促進作用，且FOXP1 表達被抑制與胃癌患者不良預后存在密切聯系。

叉頭框蛋白Q1(FOXQ1)是轉錄因子家族成員之一，定位在6p25.3 的腫瘤基因座，可參與調節上皮細胞間充質轉化、調節Wnt/β-catenin 通路、抑制平滑肌特異性基因的啟動子活性及促進大多數腫瘤細胞的侵襲和遷移等，與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關[19-20]。FOXQ1 蛋白在胃癌、胰腺癌、結直腸癌、肝癌等多種消化道惡性腫瘤的發生發展中的作用國內外已有研究。王城等[21]研究報道，沉默FOXQ1 基因的表達能夠抑制肝癌SMMC-7721細胞的遷移、侵襲能力。鄧大煒等[22]研究報道，FOXQ1 蛋白在胰腺癌干細胞中過表達，且FOXQ1的mRNA 表達量也增加。LIU 等[23]研究報道，結直腸癌組織中FOXQ1 蛋白過表達與患者預后不良密切相關。崔曉海等[24]研究報道，FOXQ1 蛋白在胃癌組織中高表達，且與TNM 分期、淋巴結轉移、浸潤深度密切相關。本研究結果顯示，胃癌組織中FOXQl 蛋白高表達率高于癌旁組織(P＜0.05)；胃癌組織中FOXQl 蛋白表達與腫瘤大小、病理分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移、浸潤深度及脈管神經侵犯相關(P＜0.05)；多因素Cox 回歸分析結果顯示，FOXQ1 高表達是影響胃癌患者OS 的獨立危險因素(P＜0.05)；Kaplan-Meier 分析結果顯示，FOXQ1 高表達組者OS 累積生存率低于高表達患者(P＜0.05)。結果表明，FOXQ1 蛋白高表達與胃癌的發生發展及預后密切相關。

本研究中，Spearman 相關性分析結果顯示，在胃癌組織中，FOXP1 和FOXQ1 蛋白的表達情況呈負相關(P＜0.05)；Cox 回歸分析結果顯示，FOXP1低或無表達/FOXQ1高表達是影響胃癌患者OS 的獨立危險因素(P＜0.05)；Kaplan-Meier 分析結果顯示，FOXP1低或無表達/FOXQ1高表達患者OS 累積生存率低于其他患者(P＜0.05)；FOXP1低或無表達/FOXQ1高表達組OS 累積生存率低于FOXP1 低或表達組和FOXQ1 高表達組(P＜0.05)。結果表明，FOXQ1 在胃癌的發生發展中是致癌基因，而FOXP1 在胃癌發生發展中是抑癌基因，FOXP1 低或無表達和FOXQ1 高表達患者預后更差，二者聯合檢測可應用于臨床判斷胃癌患者的預后。

綜上所述，FOXP1 在胃癌組織中低或無表達，FOXQ1 蛋白在胃癌組織中高表達，FOXP1 低或無表達和FOXQ1 高表達患者預后更差，兩者聯合檢測對胃癌的預后診斷價值較單獨檢測更高，同時也為胃癌的靶向治療提供了新思路。