細胞色素P450對肝移植患者他克莫司應用影響的臨床研究

周霞 湯汝佳 賀希 高銀杰 姚紅 劉振文 王洪波 劉鴻凌

各種原因引起的重癥肝病、肝衰竭、肝癌在臨床上十分常見，一般內科療法難以逆轉病情，大多數患者預后差，病死率高達50%以上[1]。肝移植是治療終末期肝病的有效手段[2-3]。而移植后存活質量提高的關鍵是合理使用免疫抑制劑。以他克莫司(Tacrolimus, Tac)為代表的鈣調神經磷酸酶抑制劑免疫活性強，已作為基礎免疫抑制劑廣泛應用于器官移植患者[1,3]。但由于其治療窗窄，個體差異較大，移植器官排異或藥物引起的相關毒性反應也時常發生[4, 5]。隨著藥物基因組學的發展，對于編碼藥物代謝酶、藥物轉運體和藥物作用靶點的基因序列的多態性研究, 越來越受到重視[2-4]。本研究通過檢測肝移植術后患者的細胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)酶的基因多態性，根據CYP特點針對性使用免疫抑制劑，觀察其臨床效果和移植術后并發癥的發生情況。

資料與方法

一、研究對象

選擇2016年4月至2019年3月在解放軍總醫院第五醫學中心接受異體原位肝移植術并存活超過1個月、年齡18～65歲、簽署知情同意書患者共146例。術后免疫抑制治療方案均采用Tac+嗎替麥考酚酯(Mycophenolate mofetil, MMF)+糖皮質激素三聯治療，除外伴有嚴重基礎疾病，包括未被控制的心、肺、腎、消化、神經、精神疾病、免疫性疾病、代謝性疾病或惡性腫瘤等。

二、病例分組與樣本采集

將患者隨機分為實驗組73例，按照CYP特點及FK506濃度調整他克莫司劑量；對照組73例，按照FK506濃度調整他克莫司劑量。比較兩組患者術后1、3、6、12個月時的Tac的谷濃度(C0)、劑量(每天每人的用藥量Dose，D)、濃度/劑量(C0/D)、肌酐水平。

服藥前30 min空腹采集患者靜脈血3 mL，全血密閉保存于含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中，用于血藥濃度測定。另取EDTA抗凝全血5 mL，于-80℃冰箱內保存，用于測序檢查。

三、FK506谷濃度檢測

FK506谷濃度采用全自動微粒酵素免疫定量分析法檢測，術后前3個月的有效濃度目標范圍為7～9 μg/L。術后1周內每天檢測，以后每周1次，后逐步延長時間。

四、血清CYP 3A4和CYP 3A5水平檢測

利用DNA提取試劑盒提取實驗組患者標本DNA，由北京索真公司負責目標片段的PCR擴增測序分析。引物設計如下：CYP3A4(rs2740574)：正鏈5′-GGCTCTGTCTGTCTGGGTTTGG-3′和反鏈5′-GCTCTTTGCTGGGCTATGTGC-3′。CYP3A5(rs776746)：正鏈5′-CCTCAGAATCCACAGCGC-TGAC-3′和反鏈5′-CCTAGTTGTACGACACAC-AGCAACC -3′。

五、統計學分析

結 果

一、患者的一般情況

實驗組和對照組患者均為73例，年齡分別為(51.4±9.0)歲和(52.2±9.4)歲，男/女比均為62/11。主要病因為HBV感染(49/73比50/73)和肝硬化失代償(66/73比57/73)；平均移植時間為(28.24±5.92)比(29.15±7.9)個月。兩組間患者的年齡、疾病組成、移植時間差異無統計學意義。實驗組內A/G、G/G、A/A亞組分別有35、33、5例患者，年齡分別為(52.6±10)、( 51.2±9.5)歲和(55.2±4.3)歲，平均移植時間為(26.89±8.83)、(32.18±6.64)和(25±6.12)個月，組間差異均無統計學意義。

二、CYP3A4、CYP3A5基因型分布

實驗組73例進行CYP3A4*1B(rs2740574)位置的檢測，均為AA型野生株；CYP3A5*3 (rs776746)位檢測分型，其中G/G突變 33例，占43.4%，A/G野生株 35例，占46.1%，A/A 突變5例，占6.6%。

三、各基因型肝移植受者術后TacC0、D和C0/D的關系

實驗組和對照組在移植術后1、3、6和12個月他克莫司給藥量、濃度以及C0/D差異無統計學意義。含CYP3A5 rs776746位G/G突變的患者在術后1、3、6和12個月他克莫司給藥劑量明顯低于未突變患者，而C0/D明顯高于未突變患者，見表1。但FK506濃度沒有明顯的差異。其中移植患者術后3個月、12個月的C0/D與年齡有關(r=-0.173，P=0.036；r=-0.172，P=0.041)。

表1 不同時期各基因型他克莫司D、C0和C0/D比值變化(±s)

四、不同基因型患者中他克莫司對血肌酐的影響

移植術后1、3、6和12個月血肌酐水平在實驗組和對照組患者間差異無統計學意義，在G/G和A/G基因型患者間也無明顯差異，見表2。術后12個月的血清肌酐水平和年齡相關(r=0.172，P=0.04)，女性患者22例，血肌酐水平明顯低于男性患者[術后1月：(64.55±20.77)比(81.22±21.43)μmol/L，t=3.378，P=0.001]。

表2 肝移植患者他克莫司對血清肌酐水平的影響(μmol/L，±s)

五、兩組患者并發癥及預后分析

實驗組和對照組患者的急性排斥反應(ACR)、感染及死亡均沒有明顯差異，見表3。實驗組中G/G變異患者感染的發病率明顯高于未變異患者(χ2=7.066,P=0.008)，也高于對照組(χ2=0.863,P=0.353)，但差異無統計學意義。

表3 肝移植患者并發癥及預后分析(例)

討 論

目前肝移植術后患者使用最多的免疫抑制劑為他克莫司，由于其藥代動力學及藥效動力學參數個體差異大，有效劑量和中毒劑量相近，移植器官排異或藥物引起毒性作用也經常發生。他克莫司代謝和清除主要通過CYP3A酶，特別是CYP3A4和CYP3A5[6-7]。CYP3A4*1B(rs2740574)位點備受關注，CYP3A4啟動子區-392位A/G的轉換，可改變CYP3A4轉錄活性和體內氧化活性，對他克莫司的藥代動力學可能存在獨立影響[8-11]。但在中國人群中，該突變率小于0.2%[12]，在本研究中并未檢出，故國外藥物劑量研究在中國人群中需要進一步分析和細化，該位點在中國人群中的差異較小，影響有限。

CYP3A5有9個等位基因，目前研究最多的是CYP3A5*3和CYP3A5*1，CYP3A5*3(rs776746)A/G突變，可導致mRNA可變剪接和蛋白質截短，從而降低CYP3A5酶的活性，影響他克莫司代謝，被推薦用于調整其初始給藥劑量及在移植患者中的個體化用藥[10, 11]。本研究中野生型占46.1%，與文獻報道比例相近[12]。在FK506濃度無明顯差異情況下，G/G突變患者他克莫司給藥劑量較低，但C0/D明顯高于未突變者，感染發病率亦明顯高于未突變組。因此，建議存在CYP3A5*3(rs2242480)突變者在接受他克莫司治療時，目標濃度設定應低于未變突變人群，可減少感染風險，用低于常規劑量他克莫司去達到免疫抑制目標。日本學者等研究也提示未變異組使用的他克莫司劑量高于變異組[13-14]。

在本研究中，實驗組和對照組間患者的FK506濃度、臨床并發癥及預后無顯著差異，證明FK506濃度仍是一個可靠的調藥依據。同時也說明，雖然參考CYP多態性降低了突變患者他克莫司給藥劑量，但仍把FK506谷濃度作為最終衡量用藥手段，所以CYP突變患者的藥物濃度和未突變者無明顯區別，導致突變患者過高的感染率，后期研究應進一步降低其目標濃度。在實驗組和對照組，CYP突變和野生型患者間排斥反應和腎損傷沒有明顯差異，但年齡和性別對血清肌酐水平有一定影響。本研究涉及CYP3A5和CYP3A4位點較少，其他位點多態性也可造成影響[15]。有研究顯示，CYP3A5非表達子可能在腎移植后早期，通過升高血清IL-6濃度而暫時降低他克莫司清除率[14]。馬多玲等[15]發現ABCBl C1236T基因多態性影響穩定期CYP3A5*3/*3腎移植受者的他克莫司濃度，ABCBl G(A)2677T和C3435T基因多態性影響受體的腎功能。

綜上所述，如果根據CYP3A特點和臨床經驗，優化他克莫司初次給藥劑量，可能減少受體的相關并發癥的發生，從而提高肝移植患者的長期生存質量。