五味解毒藥酒皮膚過敏性試驗研究

覃聰慧，黃秋燕，邱 泉，梁 平，羅 威，林國彪，李耀華

（1.廣西壯族自治區(qū)梧州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院臨床藥學科，廣西 梧州 543002；2.廣西壯族自治區(qū)梧州市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)院辦公室，廣西 梧州 543002；3.廣西中醫(yī)藥大學藥學院藥理教研室，廣西 南寧 530001；4.廣西中醫(yī)藥大學藥學院中心實驗室，廣西 南寧 530001）

五味解毒藥酒是梧州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的院內(nèi)協(xié)定方劑，其是根據(jù)名醫(yī)余培南主任醫(yī)師祖?zhèn)髅胤郊訙p而得，由小葉三點金、半邊蓮、短冠東風菜、紅背絲綢、通城虎等五味民間常用治療毒蛇咬傷的瑤藥材組成，按一定比例經(jīng)白酒浸泡一定時間制得的外用中藥制劑[1]。該藥酒具有清熱解毒、祛風除濕、活血散瘀、消腫止痛止癢等功效，外用治療毒蛇咬傷、毒蟲咬傷、蜂蟄傷等。該藥酒在我院臨床應用多年，在治療毒蛇咬傷中具有顯著的臨床療效。毒蛇咬傷中毒是由于蛇毒中的毒素引起病變。蛇毒成分復雜，毒蛇咬傷的危害性很大，輕者僅有瘙癢、麻木感或者劇痛，明顯腫脹，伴瘀斑、血皰或組織壞死、潰爛等，可出現(xiàn)發(fā)熱、煩躁不安、心律失常及各種出血等全身癥狀；重者可有循環(huán)衰竭或腎功能衰竭，或可出現(xiàn)呼吸肌麻痹而死亡，同時還會出現(xiàn)休克、心力衰竭、急性腎衰竭及彌散性血管內(nèi)凝血等治療等嚴重并發(fā)癥。目前國內(nèi)外治療毒蛇咬傷特效藥是抗蛇毒血清，治療毒蛇咬傷效果肯定，越短時間內(nèi)注射抗蛇毒血清對機體越有益。但抗蛇毒血清一般的醫(yī)院不常規(guī)備藥，而且其貯藏條件為2 ℃～8 ℃，用藥前必須進行皮試，因此抗蛇毒血清在應用上受到了很大的限制。而五味解毒藥酒則可以彌補抗蛇毒血清難于保存、使用復雜的缺點，因此加快五味解毒藥酒的研發(fā)，將其制成質(zhì)量穩(wěn)定可控、療效確切、方便臨床應用的醫(yī)院制劑具有重要意義。本實驗主要觀察五味解毒藥酒外用對皮膚的致敏性，以期為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 五味解毒藥酒（生產(chǎn)批號14010901），由梧州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供。米酒（賦形劑）（浙江國鏡藥業(yè)有限公司，度數(shù)50°）。2,4-二硝基氯苯（成都格雷西亞化學技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號201208071）臨用前用分析純的丙酮配制成1%的致敏濃度和0.1%的激發(fā)濃度。硫化鈉（成都市科龍化工試劑廠，生產(chǎn)批號2016062301）。

1.2 動物 白色成年豚鼠40 只（廣東江門市新會裕豐黑豚特種養(yǎng)殖場提供），體重250～300 g，雌雄各半。于廣西中醫(yī)藥大學動物實驗中心進行實驗，室溫（24±2）℃，濕度50%～70%，實驗期間雌雄單獨分開，實行分籠喂養(yǎng)，自由飲食，自由飲用清潔自來水。

1.3 方法 取豚鼠40 只，體重250～300 g，雌雄各半，預養(yǎng)3 d，分為4 組，每組10 只。于每只背部左側(cè)脫毛，面積3 cm×3 cm。分組為賦形劑組、藥酒組、陽性組以及空白組，分別將賦形劑、0.2 ml 五味解毒藥酒、1% 2,4-二硝基氯苯、NS 分別涂布于以上各組豚鼠的左側(cè)脫毛區(qū)，6 h 后清洗干凈，觀察給藥區(qū)皮膚的情況，并于24 h 觀察給藥涂布區(qū)皮膚紅斑、水腫和其他異常反應。重復3 次給藥致敏，在末次給受試物致敏后第14 天，將賦形劑、0.2 ml 五味解毒藥酒、0.1% 2,4-二硝基氯苯、NS 分別涂于豚鼠左側(cè)脫毛區(qū)進行激發(fā)，6 h 后清洗干凈，觀察給藥區(qū)皮膚情況，并于24、48、72 h 觀察脫毛區(qū)皮膚紅斑、水腫和其他異常反應。

1.4 觀察指標與評價標準 觀察并記錄豚鼠用藥前后體重、皮膚紅斑或水腫的情況。致敏反應發(fā)生率＝有皮膚紅腫或水腫（不論程度輕重）動物數(shù)/動物總數(shù)×100%。依照皮膚致敏性評價標準推斷受試物的致敏性[2，3]，見表1、表2。

表1 皮膚過敏反應程度的評分標準

表2 皮膚致敏性評價標準

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（）表示，采用t檢驗；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚過敏性試驗對豚鼠體重的影響 試驗后4周，陽性組豚鼠體重低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；賦形劑組、五味解毒藥酒組體重低于空白組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組豚鼠體重比較（，g）

表3 各組豚鼠體重比較（，g）

2.2 皮膚過敏性試驗結(jié)果 陽性組0 h 時豚鼠皮膚出現(xiàn)中度紅斑，重度水腫，即皮膚隆起1 mm，輪廓清楚的情況，而且動物出現(xiàn)撓癢、舔給藥區(qū)情況，其中10只出現(xiàn)中度紅斑（10×2）分，9 只出現(xiàn)重度水腫為（9×3）分，1 只出現(xiàn)中度水腫為2 分，平均積分為（4.90±0.32）分；24 h 時發(fā)現(xiàn)皮膚水腫情況有輕微改善，其中10 只出現(xiàn)中度紅斑為（10×2）分，6 只出現(xiàn)重度紅斑為（6×3）分，3 只出現(xiàn)中度水腫（3×2）分，1 只出現(xiàn)輕度水腫為1 分，平均積分為（4.50±0.71）分；48 h時觀察皮膚為中度紅斑和輕度水腫的情況，其中10只出現(xiàn)中度紅斑為（10×2）分，1 只出現(xiàn)輕度水腫為1 分，平均積分為（2.10±0.32）分；72 h 時皮膚為輕度紅斑，水腫消失的情況，其中1 只出現(xiàn)中度紅斑為2分，9 只出現(xiàn)輕度紅斑為9 分，平均積分為（1.10±0.32）分，致敏率為100.00%。藥酒組、空白組和賦形劑組的動物皮膚未出現(xiàn)紅斑和水腫的情況，動物活動正常，未有異常反應，致敏率均為0。

3 討論

臨床前藥理毒理研究是藥物臨床前試驗的非常重要的組成部分，為臨床合理用藥及新藥注冊提供參考，其中一項中藥內(nèi)容就是藥物過敏性、溶血性和刺激性試驗[4]。五味解毒藥酒為外用制劑，它通過透皮吸收而起到相應的藥理效應，在這個作用過程中，經(jīng)過一定的潛伏期，也可能作為刺激物或者致敏物質(zhì)對接觸的皮膚產(chǎn)生皮膚過敏反應性炎癥。過敏性試驗是通過動物重復接觸受試物后，觀察機體免疫系統(tǒng)在皮膚上的反應[3]，是應用受試物后產(chǎn)生免疫學傳遞的一種皮膚反應[5]。在動物首次接觸供試品一段時間后再次進行供試品的激發(fā)接觸，可觀察動物是否已出現(xiàn)過敏狀態(tài)，然后再通過激發(fā)接觸后的反應來判定受試動物有無發(fā)生過敏反應[6]。致敏反應常見于局部涂敷各種藥物，具有致敏性的藥物是廣泛的，新藥臨床研究前，應注意藥物的致敏性，應用于皮膚、粘膜等局部用藥、與已知具有致敏性的藥物結(jié)構(gòu)或藥理作用類似者或在藥物合成生產(chǎn)中已表現(xiàn)出或可疑引起皮膚刺激、皮炎或接觸性皮炎等三種情況應優(yōu)先考慮致敏試驗[7]。五味解毒藥酒是由小葉三點金、半邊蓮、短冠東風菜、紅背絲綢、通城虎等瑤藥材組成，其賦形劑為50°白酒，用藥途徑為患部皮膚涂擦，其化學成分復雜，目前尚未完全明確，賦形劑以及用藥途徑均符合優(yōu)先考慮致敏試驗的情形。

本研究結(jié)果顯示，用藥進行3 次致敏后2 周，稱取豚鼠體重，陽性組豚鼠體重低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；賦形劑組、藥酒組體重低于空白組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這可能跟陽性藥對豚鼠皮膚致敏較重有關(guān)，使豚鼠不適，從而明顯影響該組豚鼠的食欲。而藥酒組和賦形劑組的豚鼠體重變化值與空白組無差異，這表明五味解毒藥酒和賦形劑對豚鼠體重均沒有明顯影響。此外，整個實驗過程中藥酒組、空白組和賦形劑組的豚鼠皮膚整個實驗過程均未出現(xiàn)紅斑和水腫的情況，積分總和均為0，致敏率均為0。陽性組豚鼠的皮膚在試驗整個過程均有不同程度的紅斑和水腫出現(xiàn)，致敏率為100.00%，這表明五味解毒藥酒外用對豚鼠的皮膚無致敏性，提示五味解毒藥酒在動物試驗中過敏反應可能性小。由于毒蛇在野外生存身上不免帶有許多病菌，蛇傷患者咬傷部位常帶有細菌，極易引起皮膚軟組織感染，臨床救治中常會使用抗菌藥物進行抗感染治療。由于五味解毒藥酒是以高度白酒浸泡而得，與有些抗菌藥物容易產(chǎn)生雙硫侖樣反應，因此與其他藥物聯(lián)合使用時，尤其應警惕雙硫侖樣反應。此外，有三個方面的細節(jié)值得注意，第一是五味解毒藥酒是液體，在對豚鼠皮膚涂擦時，可能比較容易流失到其他部位，為了避免藥液的流失，應少量藥液分多次慢慢涂布，涂布后的豚鼠應單獨留置，待藥液全部吸收揮干后，在放回籠子；第二是本次皮膚過敏性試驗所使用的致敏劑是2,4-二硝基氯苯，這個致敏劑的配制較為特殊，應加以注意，在配制時，應保溫在50 ℃的熱水中進行，而且必須現(xiàn)配現(xiàn)用，溫度過高時溶液容易產(chǎn)生油珠，而溫度過低時幾乎不溶或者配制好的溶液由于溫度下降會析出結(jié)晶吸附在容量瓶底或者阻塞移液槍頭，影響實驗結(jié)果；第三，本實驗周期長，豚鼠之間存在個體差異，有些豚鼠脫毛區(qū)的毛發(fā)生長迅速，這對觀察豚鼠皮膚黏膜的變化產(chǎn)生一定的影響，因此，在實驗過程中應注意根據(jù)脫毛區(qū)毛發(fā)的生長情況進行一次甚至多次剃毛[8]。

綜上所述，五味解毒藥酒對豚鼠的皮膚無致敏性，是較安全的局部外用制劑。