FACSAriaⅢ流式細胞儀分選小鼠肺臟自然殺傷細胞方法的建立與評價

戶乃麗，徐曉雪，鄒林樾，田 蜜

（首都醫科大學中心實驗室，北京 100069）

自然殺傷（natural killer，NK）細胞是機體天然免疫系統的重要組成部分，與抗病毒免疫、移植免疫、自身免疫疾病及腫瘤免疫密切相關[1,2]。不同種屬NK 細胞的特征性表面標記有所不同，人NK 細胞通常以CD56+CD3－表型來進行鑒定，而在小鼠中NK1.1、NKp46 和CD49b（DX5）等往往被用作鑒定NK 細胞的標志分子[3,4]。NK 細胞在體內含量較低，獲取高純度高活性的NK 細胞對于進一步研究具有重要意義。免疫磁珠分離是目前常用的純化NK 細胞的方法之一，利用磁珠分選脾臟、血液等組織可得到純度90%以上的NK 細胞。由于肺臟屬于較韌的實質組織，含有大量的結締組織，處理過程中需要膠原酶消化，過程中會產生一定的死細胞，磁珠分選后會有部分活性不佳的NK 細胞殘留，影響分選后細胞活性。本實驗擬利用密度梯度離心結合流式細胞4 色標記分選，加入識別細胞死活的染料，建立一種高速高效分離純化小鼠肺臟NK 細胞的方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取5 只雄性C57BL/6 小鼠，SPF級，體質量28～30 g，5～6 周齡，購于首都醫科大學實驗動物部，飼養溫度20 ℃～25 ℃，濕度40%～70%。單籠飼養，正常飲水進食。

1.2 試劑與儀器 RPMI-1640 培養基、胎牛血清購自Gibco 公司；膠原酶V、臺盼藍試劑購自Sigma Aldrich公 司；FVS510、CD3-FITC、CD19-FITC、NKp46-PE、NK1.1-APC 抗體為Biolegend 公司產品；紅細胞裂解液、流式細胞儀質控CST 微球、Accudrop beads 購自BD 公司；實驗所用儀器為BDAriaⅢ型流式細胞分選儀，配有488 nm、561 nm、633 nm、405 nm 四只激光器。

1.3 方法

1.3.1 肺單細胞懸液的制備 小鼠處死，開胸取出肺組織，PBS 反復清洗，剪除氣管支氣管，將肺組織輕柔剪成1～2 mm 3 小塊，將組織加入37 ℃的新原酶Ⅴ消化液中，置入37 ℃的水浴箱中，每隔5 min 輕輕振搖1 次，約60 min 時可見肺組織被全部消化；輕輕吹打分散細胞，收集消化液200 目不銹鋼網過濾，離心去上清后加入PBS 重懸細胞再次離心去上清；加入紅細胞裂解液5 ml，冰上孵育10 min，離心去上清；加入PBS 離心漂洗1～2 次，去上清，得到小鼠肺單細胞懸液。

1.3.2 流式細胞染色 取分離的細胞細胞，計數并用500 μl PBS 定容懸浮，根據說明書配比加入FVS510染料孵育1 h，PBS 洗滌2 次，Fc-R 阻斷劑封閉后再依次加入CD3-FITC、CD19-FITC、NKp46-PE、NK1.1-APC 避光孵育1 h，PBS 洗滌2 次，調整體積為1 ml，待上機檢測及分選。

1.3.3 分選液流參數和斷點的調節 流式細胞儀鞘液桶和水桶用75%酒精浸泡消毒4 h 以上，用純水沖洗干凈，鞘液桶中加入無菌PBS，運行開機程序，安裝85 μm 噴嘴，分選電壓4500 V，Freq 設定為47.4，調節液滴振幅Ampl 值使液流處于穩定狀態,而后選中主液流框的sweet spot 鍵，儀器會自動維持液流穩態。上樣Accudrop beads 微球調節液滴延遲為30.31，使得微球在initial 或fine tune 模式下都達到側液流偏轉以99%以上。上樣后通過空白和陰性對照管調節儀器參數圈定陽性細胞，分FVS510-CD3-CD19-NK1.1+NKp46+的NK 細胞，接收管中預置0.5 ml 培養基接收分選所得細胞。

1.3.4 分選后純度檢測 吸取400 μl 分選后的細胞上流式細胞儀，在原分選方案中檢測分選后細胞的純度。

1.3.5 分選后細胞存活率檢測 吸取新提取的細胞懸液90 μl，加入0.4%臺盼蘭溶液10 μl，充分混勻后，加入改良的牛鮑計數板，顯微鏡下觀察細胞見未被染色細胞為活細胞。細胞存活率=染色陰性細胞數/細胞總數×100%。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計軟件對數據進行分析。計量資料以（）表示，進行單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞儀液流斷點及液滴延遲 第一滴液流斷點位置Drop1 為345，Gap 為9，液流開啟0.5 h 以上無晃動，無斷點位置改變，穩定性良好，各種參數符合分選條件，見圖1。

圖1 調節后穩定的液流斷點狀態和液滴延遲調節結果

2.2 流式細胞儀檢測并分選NK 細胞 分選前NK 細胞占總細胞（4.40±1.20）% Total，分選后為（96.10±2.20）% Total，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 分選前后NK 細胞純度比較

2.3 分選后NK 細胞存活率 經臺盼藍染色顯示分選后細胞存活率為（95.70±2.02）%，細胞形態良好，見圖3。

圖3 臺盼藍染色分選后NK 細胞（×100）

3 討論

NK 細胞是先天免疫系統的重要組成部分[5-7]，是一類獨特的淋巴細胞亞群，NK 細胞不同于T 細胞、B 細胞，是一類無需預先致敏就能非特異性殺傷病毒感染細胞和腫瘤細胞的淋巴細胞，占外周血淋巴細胞總數的10%～15%。NK 細胞在小鼠肺臟含量僅次于脾臟，得到高純度高活性的NK 細胞對于研究其功能具有重要意義。目前常用的細胞純化方法主要有磁珠分選法和流式分選法[8，9]，磁珠分選多用于脾，血液等易于獲取單細胞的組織，經過陰性選擇和陽性選擇兩步可得到純化率約90%的NK細胞[10，11]。而流式分選法對于稀有細胞和成份混雜的組織樣品的分選具有更大的優勢。

在小鼠中，NK 細胞通常被定義為CD3-NK1.1+或者CD3-NKp46+，NK 細胞的亞群劃分主要依據CD11b、CD27、KLRG1 和CD226 等分子的表達[12-14]，由于NK 細胞存在于非T、B 淋巴細胞群，因此選取CD3-CD19-NKp46+NK1.1+細胞群為目的細胞進行分選，而在抗體選擇上，標記T、B 細胞的CD3、CD19，選擇同樣熒光素標記的抗體，可簡化實驗的配色方案。由于分選的樣品來源于組織，經過消化和離心過程會產生死細胞，死細胞的存在會增加非特異著色，同時也會影響分選后細胞的純度和活性，因此，在進行染色結果分析時，需加入識別細胞死活的染料。目前流式多用的細胞死活染料分為兩大類，核酸染料和氨基反應性染料[15]，核酸染料以7-AAD 為主，主要適用于非固定細胞的表面標記物的染色。7-AAD 的優點在于染色快捷，樣品上機前加入，無需洗滌，缺點是7-AAD 的激發和發射光譜范圍較寬，且與Percp，PE-CY5 等熒光染料存在較大光譜重疊，檢測時應注意調節補償或避免共同使用。氨基反應性染料適用于活細胞和破膜固定的細胞的死活染色，染色后需要洗滌，根據儀器激光配置和配色方案有多種光譜的染料可供選擇。本實驗中選擇的細胞死活染料為FVS510，與FITC 存在一定漏光，樣品檢測時需設立單陽樣品或熒光補償微球調節FVS510 與FITC 之間的補償值。

對于FACSAriaⅢ型流式細胞儀，選擇85 μm噴嘴，控制上樣速度為8000～10000 evts/s，是較適宜的分選條件，得到的NK 細胞數量和活力俱佳。上樣速度過高會使得分選回收率下降，造成部分陽性細胞被丟棄，分選速度過低會延長分選時間，不利于維持細胞活性[16]。在流式細胞儀分選設置上，首先要注意調節穩定的液流參數，液流的穩定是保證分選準確進行的基礎，分選過程中開啟液流“sweet spot”模式，一旦液流不穩定時分選能夠自動停止，防止液滴飛濺污染影響收集管中細胞的陽性率。此外，液滴延遲的調節是十分重要，可自動結合手動重復調節確定正確的Drop delay 數值，一旦液流參數發生變化，需要重新校準Drop delay，這些是保證分選進行的基本條件。通過上述手段，可將含量為（4.40±1.20）% Total 的NK 細胞富集到（96.10±2.20）% Total，且活細胞數量達到95%以上，細胞形態良好，可用于后續的實驗研究。

綜上所述，利用流式細胞分選儀可快速高效分離小鼠肺臟NK 細胞，分選后的細胞保持良好的活性，為進一步研究NK 細胞提供了保證。