溫度對臍帶血單個核細胞和干細胞的影響

燕法紅，林彩蓮，孫鳳強，莊洪霞，朱玉春，居瑞雪

（濰坊醫學院第一附屬醫院/濰坊市人民醫院血液內科1，產科2，檢驗科3，山東 濰坊 261041）

臍帶血（cord blood）是一種重要的造血干細胞來源，保持臍帶血的有效質量與數量對造血干細胞移植的成功至關重要。臍帶血的質量與數量受到多種因素的影響，涉及采集、運輸、保存、冷凍、融化等多個環節[1]。其中，臍帶血的運輸及保存就是其中一個重要方面，運輸及保存的時間及溫度等都可能影響臍帶血的質量與數量。對于臍帶血的最佳運輸及保存條件，目前研究存在一定分歧。德國制定了臍帶血運輸保存的規范，要求臍帶血在采集后48 h 內送至臍血庫并予以處理、凍存，在此期間的溫度必須保持在（22±4）℃。目前其他國家對臍帶血的運輸及保存的時間與溫度等條件沒有明確規定[2]。隨著交通條件的改善，物流速度的加快，臍血庫數量的增多，目前臍帶血的運輸時間已大大縮短，一般臍帶血在采集后十余小時內均可到達臍血庫。本研究擬觀察臍帶血采集后12 h 保存于4 ℃與室溫對干細胞及單個核細胞的影響，以探索臍帶血運輸與保存的最佳溫度。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PC7-anti CD45、PE-anti CD34 流式抗體購自美國Becton Dickinson 公司，淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，裂紅液購自美國Becton Dickinson 公司，肝素鈉購自成都市海通藥業有限公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自天津灝洋華科生物科技有限公司，血細胞分析儀為日本Sysmex 公司產品，流式細胞儀為美國Beckman Coulter 公司產品。

1.2 人臍帶血采集及處理 16 份人臍帶血來自濰坊醫學院第一附屬醫院2020 年7 月～10 月健康產婦。在50 ml 無菌注射器中加入1 支肝素鈉（12500 U），臍帶娩出后用注射器抽取30 ml 臍帶血，立即平均分為兩組，分別為4 ℃組與室溫組，前者放置于4 ℃冰箱，后者放置于室溫（22±4）℃，均放置12 h。此后的處理步驟兩組一致，以減少干擾與誤差，除離心外均放置在4 ℃（或者冰水浴）。

1.3 密度梯度離心法分離干細胞（MNC）與MNC 計數 臍帶血放置12 h 后，1200 r/min 離心7 min，吸取白膜層，加入等體積PBS 后混勻，緩慢加入到含有淋巴細胞分離液的離心管中，2000 r/min 緩慢離心20 min。吸取MNC，加入10 ml PBS，1200 r/min離心7 min，棄上清，以PBS 重懸至1 ml。用血細胞分析儀檢測血常規，白細胞濃度除以15，記錄為每毫升臍帶血所采集的MNC 數，然后進行流式檢測。

1.4 流式細胞術檢測CD34+細胞比例 每組取50 μl充分混勻后的臍帶血，若MNC 濃度過高可進行稀釋，每組加入PC7-anti CD45、PE-anti CD34 流式抗體各5 μl，避光孵育20 min。加裂紅液，放置10 min。加PBS，300 g 離心5 min，棄上清。再洗一遍。以PBS重懸細胞，用流式細胞儀檢測。以CD45/SSC 設門，定位白細胞群。分析CD34+細胞占CD45+細胞的比例，然后乘以MNC 數，得出CD34+細胞的數量。

1.5 統計學分析 數據采用SPSS 22.0 進行統計。各組資料經檢驗為正態分布后，計量資料以（）表示，比較采用配對樣本的t檢驗。應用線性相關，分析不同溫度下CD34+細胞數與MNC 數的相關性，應用GraphPad Prism5 軟件作圖。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臍帶血MNC 數、CD34+細胞比例及CD34+細胞數比較 4 ℃組與室溫組MNC 數分別為（9.28±4.65）×108/L、（20.11±8.37）×108/L，4 ℃組MNC 數低于室溫組（t=-5.283，P＜0.05）。4 ℃組與室溫組CD34+細胞比例分別為（1.10±0.56）%、（0.55±0.24）%，4℃組高于室溫組（t=4.348，P＜0.05）。4 ℃組與室溫組CD34+細胞數分別為（9.41±5.08）×106/L、（10.80±5.40）×106/L，兩組比較，差異無統計學意義（t=-1.265，P=0.225），見圖1。

圖1 兩組臍帶血MNC 數、CD34+細胞比例及CD34+細胞數比較

2.2 CD34+細胞數與MNC 的相關性 4 ℃組CD34+細胞數與MNC 無相關性（r=0.295，P=0.267）；室溫組CD34+細胞數與MNC 呈正相關（r=0.551，P=0.027）。

3 討論

對于臍帶血凍存前的最佳保存溫度、溫度對臍帶血中的干細胞及其他成分的影響，部分學者從不同的角度對此進行了研究，但研究的結論并不一致。部分研究認為室溫保存可獲得較好的效果，Moldenhauer A 等[3]認為，在25 ℃時MNC 與CD34+細胞明顯高于4 ℃，集落形成單位（CFU）的形成能力優于4 ℃。Maeng JY 等[4]發現在24 ℃保存比4 ℃保存下CFU 數量增多，但CD34+細胞活性無明顯差別。Pereira-Cunha FG 等[5]發現臍帶血在室溫保存至96 h，能較好地保存各種細胞成分的活性。Guttridge MG 等[6]證實臍帶血在室溫保存3 d，CD34+細胞活性不受影響，但CD45+細胞活性明顯下降。另一部分研究則認為4 ℃保存更優越，如Pamphilon D 等[7]認為4 ℃保存比室溫可獲得更多的總有核細胞（TNC）數、MNC 數、CD45+活細胞，但CD34+活細胞與CFUGM 之間無差別。Fry LJ 等[8]認為4 ℃～8 ℃保存比室溫保存可得到更多的CD45+細胞、CD34+細胞、粒細胞與MNC。Louis I 等[9]認為4 ℃保存比室溫可明顯提高MNC、CD45+、CD34+細胞活性和復蘇能力，但CFU 形成能力無差別。另外一部分研究則認為4 ℃保存與室溫保存差別不大[10,11]。Strobel J 等[2]研究了2460 例臍帶血，發現不同的保存溫度總體上對CD34+活性及CFU 影響不大，但20 ℃～24 ℃保存會略顯優勢。

本研究發現，室溫組與4 ℃組CD34+細胞數基本相同，與部分研究一致[4,6,10,11]。臍帶血中干細胞數的多少與細胞凋亡、抗凝—纖溶系統的變化等因素有關[3,10]，有研究認為室溫與4 ℃保存時臍帶血中的干細胞凋亡無明顯差別[10]，與本次研究結果相吻合。Radke TF 等[10]發現臍帶血采集后72 h 之內，在4 ℃與26 ℃保存時CD34+細胞均沒有發生死亡，但可發生凋亡，但兩種溫度下的細胞凋亡差別不大；只有在較高的37 ℃條件下CD34+細胞死亡和凋亡才進一步增加，細胞形態也隨之發生變化。本次研究沒有納入37 ℃保存，由上可以看出，在臍帶血采集后的一定時間內，4 ℃與室溫保存時CD34+細胞的損失無明顯差別，可以解釋本研究中臍帶血在采集12 h后保存在兩種溫度下CD34+細胞的數量沒有差別。對于MNC 的變化，本研究發現，室溫組MNC 數高于4 ℃組，與有關研究一致[3]。由于低溫環境可釋放有害物質，細胞吸收后可引起損傷[12]，MNC 數量的下降可能與其有關。Pereira-Cunha FG 等[5]觀察了室溫保存96 h 內臍帶血中不同MNC 組分的變化，結果發現，隨著時間推移，單核細胞與不成熟B 淋巴細胞維持穩定，成熟B 淋巴細胞下降，而CD34+細胞與成熟T 淋巴細胞升高。整體上來說，MNC 是基本維持穩定的。本研究還發現，室溫組CD34+細胞數與MNC 數呈正相關，而4 ℃組CD34+細胞數與MNC 數無相關性，考慮仍與低溫損傷MNC 有關，導致4 ℃時二者數量上的不平衡。

綜上所述，室溫保存比4 ℃更有利于同時保護干細胞與MNC。但本研究尚存在一定的局限性，僅從干細胞與MNC 細胞數量的角度進行觀察，沒有對TNC 數、復蘇后細胞活性、CFU 形成能力等進行檢測。相關研究值得進一步深入開展，更全面地觀察不同保存條件下臍帶血一系列參數的變化，為臍帶血的保存提供可靠的理論基礎。