黃芩苷介導Nrf2/HO-1通路的激活增強丙泊酚對腎缺血再灌注損傷大鼠的保護作用*

李前輝，張宜林，謝小娟，郭浩翔，王翔宇

河南科技大學第一附屬醫院，河南 洛陽 471023

腎臟是高度灌注的器官，對缺血非常敏感，缺血再灌注損傷是導致各種臨床環境下急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的主要原因，如腎移植、心血管外科、低血容量和膿毒性休克[1]。由于腎小管上皮細胞損傷、內皮功能障礙及異常修復，AKI可能發展為慢性腎臟疾病[2-3]。缺血再灌注損傷是一種病理現象，其中腎臟組織和細胞損傷是由于血液再灌注后的缺血加重引起的，是導致腎功能衰竭和預后不良的關鍵因素[4-5]。到目前為止，尚未確定對腎臟缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)的確切治療方法，因此研究減輕RIRI引起的損害的策略至關重要[6]。

黃芩苷(baicalin，BAI)是提取自唇形科植物黃芩干燥根的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌等作用[7-10]。研究表明，BAI通過下調TLR2/TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達，抑制炎癥和細胞凋亡而改善RIRI[11]。丙泊酚(propofol，Prof)通過降低CXCR4蛋白表達改變血管舒縮性減輕RIRI[12]。目前還未見BAI聯合Prof對RIRI研究的相關報道，本文旨在探究BAI聯合Prof對RIRI大鼠的影響。

1 材料

1.1 動物60只雄性SPF級SD大鼠，6～8周齡，體質量(200±20)g，購自浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，許可證號：SCXK(浙)2018-0003。飼養于12 h/12 h明暗交替、溫度23～25 ℃、濕度45%～55%的條件。

1.2 藥物與試劑BAI(純度≥95.4%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201821)；Prof(純度≥99.9%，中國食品藥品檢定研究院，批號：100806-20180)。戊巴比妥鈉、ML385(美國Sigma公司，批號分別為：4390-14-3、SML1833)；蘇木素-伊紅染液、肌酐(serum creatinine，Scr)試劑盒、尿素氮 (blood urea nitrogen，BUN)測試盒、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號分別為：D006-1-1、C011-2-1、C013-2-1、A001-3-2、A003-1-2)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、40 ng·L-1多聚甲醛、BCA蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗人IgG、極超敏ECL化學發光試劑盒(上海碧云天生物技術研究所，貨號分別為：C1091、P0099、P0012、A0208、P0018FM)；Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1抗體(美國Abcam公司，貨號分別為：ab31163、ab137550、ab13243、ab34173)。

1.3 儀器BS-280型全自動生化分析儀(南京貝登醫療股份有限公司)；DM750型熒光顯微鏡(德國Leica公司)；Varioskan LUX型多功能酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；U-T6A型紫外可見分光光度計(上海屹譜儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 動物模型建立與分組按隨機數字表法將大鼠分為5組：Sham組、BAI組、RIRI組、RIRI+Prof組和RIRI+Prof+BAI組，每組12只。腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉所有大鼠，對所有大鼠進行中線剖腹和右腎切除術，暴露左腎，用非創傷性血管鉗夾緊左腎動脈，誘導缺血1 h，松開動脈后，再灌注24 h，Sham組和BAI組僅暴露左腎。當觀察到腎表面顏色從暗紫色變化為血色時，表明血流恢復，RIRI模型制備成功[12]。BAI組灌胃黃芩苷30 mg·kg-1[13]，RIRI+Prof組灌胃丙泊酚50 mg·kg-1[14]，RIRI+Prof+BAI組同時灌胃黃芩苷30 mg·kg-1和丙泊酚 50 mg·kg-1，Sham組和RIRI組灌胃等體積生理鹽水，連續給藥 7 d。

2.2 檢測大鼠腎功能指標收集各組大鼠尿液、血液，用全自動生化分析儀檢測尿液中蛋白質含量，離心后的上清液用全自動生化分析儀檢測Scr、BUN水平。

2.3 檢測大鼠血清氧化應激指標取大鼠血清，按試劑盒說明書測定SOD活力、MDA含量。

2.4 HE染色觀察大鼠腎臟損傷情況每組隨機選3只大鼠，取腎臟，先用40 ng·L-1多聚甲醛固定48 h，然后石蠟包埋制作呈切片，切片5 μm厚，用蘇木精、伊紅染色。在顯微鏡下觀察腎組織病理損傷變化。

2.5 TUNEL染色檢測腎臟的細胞凋亡將HE染色的大鼠腎組織切片用二甲苯浸洗2次脫蠟，每次5 min，梯度乙醇脫水；用蛋白酶K工作液在 37 ℃ 下封閉20 min，PBS清洗2次；在每個切片樣本上加入50 μL TUNEL反應液，37 ℃避光反應 60 min；用DAPI復染10 min在后熒光顯微鏡下進行觀察。

2.6 Western blot法檢測大鼠腎臟相關蛋白表達每組隨機選3只大鼠，取腎組織，提取總蛋白并測定其含量；SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉移至PVDF膜，在4 ℃下加入相應一抗并孵育過夜，清洗，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育2 h，最后加入ECL發光液，曝光處理。Image J軟件統計灰度值。

2.7 加入Nrf2/HO-1通路抑制劑ML385后BAI聯合Prof對RIRI大鼠的影響模型建立方法同2.1，將大鼠隨機分為6組：Sham組、RIRI組、RIRI+Prof組、RIRI+Prof+BAI組、RIRI+Prof+ML385組和RIRI+Prof+BAI+ML385組。Western blot法檢測大鼠腎組織Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達；TUNEL染色檢測大鼠腎細胞凋亡；檢測大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA、SOD含量。

3 結果

3.1 BAI聯合Prof對RIRI大鼠BUN、Scr水平及腎臟病理損傷的影響大鼠尿液中BUN、Scr水平結果見圖1A、1B，與Sham組比較，RIRI組大鼠尿液BUN、Scr水平顯著升高(P<0.01)；與RIRI組比較，RIRI+Prof組大鼠尿液BUN、Scr水平明顯降低(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI組大鼠尿液BUN、Scr水平顯著降低(P<0.01)；與RIRI+Prof組比較，RIRI+Prof+BAI組大鼠尿液BUN、Scr水平明顯降低(P<0.05)。大鼠腎組織病理損傷程度結果見圖1C，Sham組及BAI組大鼠腎組織結構完整，腎間質無水腫充血；RIRI組大鼠腎組織可見明顯腎缺血再灌注損傷，腎小球體積增大、系膜增生，間質區可見淋巴細胞浸潤，腎小球細胞呈空泡變性；RIRI+Prof組和RIRI+Prof+BAI組大鼠腎組織較RIRI組病理損傷程度明顯改善。

注：與Sham組比較，**P<0.01；與RIRI組比較，#P<0.05，##P<0.01；與RIRI+Prof組比較，& P<0.05圖1 BAI聯合Prof對RIRI大鼠BUN、Scr水平和腎臟病理損傷的影響

3.2 BAI聯合Prof對RIRI大鼠血清SOD、MDA含量的影響大鼠血清SOD、MDA含量結果見圖2A、2B，與Sham組比較，RIRI組大鼠血清SOD活力顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)；與RIRI組比較，RIRI+Prof組大鼠血清SOD活力明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI組大鼠血清SOD活力顯著升高(P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01)；與RIRI+Prof組比較，RIRI+Prof+BAI組大鼠血清SOD活力明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)。

3.3 BAI聯合Prof對RIRI大鼠腎組織細胞凋亡的影響大鼠腎細胞凋亡結果見圖3A、3B，與Sham組比較，RIRI組大鼠腎組織細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與RIRI組比較，RIRI+Prof組大鼠腎組織細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI組大鼠腎細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)；與RIRI+Prof組比較，RIRI+Prof+BAI組大鼠腎組織細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。大鼠腎組織Bax、Bcl-2蛋白表達結果見圖3C、3D，與Sham組比較，RIRI組大鼠腎組織Bcl-2/Bax水平顯著降低(P<0.01)；與RIRI組比較，RIRI+Prof組大鼠腎組織Bcl-2/Bax水平明顯升高(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI組大鼠腎組織Bcl-2/Bax水平顯著升高(P<0.01)；與RIRI+Prof組比較，RIRI+Prof+BAI組大鼠腎組織Bcl-2/Bax水平明顯升高(P<0.05)。

注：與Sham組比較，**P<0.01；與RIRI組比較，#P<0.05，##P<0.01；與RIRI+Prof組比較，& P<0.05圖2 BAI聯合Prof對RIRI大鼠SOD、MDA含量的影響

注：與Sham組比較，**P<0.01；與RIRI組比較，#P<0.05，##P<0.01；與RIRI+Prof組比較，& P<0.05圖3 BAI聯合Prof對RIRI大鼠腎組織細胞凋亡的影響

3.4 BAI聯合Prof對RIRI大鼠腎組織p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達的影響大鼠腎組織Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達見圖4，與Sham組比較，RIRI組大鼠腎組織p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與RIRI組比較，RIRI+Prof組大鼠腎組織p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表達明顯升高(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI組大鼠腎組織p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與RIRI+Prof組比較，RIRI+Prof+BAI組大鼠腎組織p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。

注：與Sham組比較，**P<0.01；與RIRI組比較，#P<0.05，##P<0.01；與RIRI+Prof組比較，& P<0.05圖4 BAI聯合Prof對RIRI大鼠腎組織Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達的影響

3.5 加入Nrf2/HO-1通路抑制劑ML385后BAI聯合Prof對RIRI大鼠的影響大鼠腎組織Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達結果見圖5A、5B，與Sham組比較，RIRI組大鼠腎組織p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與RIRI組比較，RIRI+Prof組、RIRI+Prof+BAI組大鼠腎組織p-Nrf2/Nrf2水平、HO-1、NQO1蛋白表達顯著升高(P<0.01;P<0.05)；與RIRI+Prof組比較，RIRI+Prof+BAI組大鼠腎組織p-Nrf2/Nrf2水平、HO-1、NQO1蛋白表達明顯升高(P<0.05)，RIRI+Prof+ML385組p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與RIRI+Prof+ML385組比較，RIRI+Prof+BAI+ML385組大鼠腎組織p-Nrf2/Nrf2水平、NO-1、NQO1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。大鼠腎細胞凋亡結果見圖5C、5D，與Sham組比較，RIRI組大鼠腎組織細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與RIRI組比較，RIRI+Prof組大鼠腎組織細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI組細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)；與RIRI+Prof組比較，RIRI+Prof+BAI組大鼠腎組織細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，RIRI+Prof+ML385組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與RIRI+Prof+ML385組比較，RIRI+Prof+BAI+ML385組大鼠腎臟凋亡率明顯降低(P<0.05)。大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA、SOD含量結果見圖5E、5F、5G、5H，與Sham組比較，RIRI組大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量顯著升高(P<0.01)，血清SOD活力顯著降低(P<0.01)；與RIRI組比較，RIRI+Prof組大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量明顯降低(P<0.05)，血清SOD活力明顯升高(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI組大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量顯著降低(P<0.01)，血清SOD活力顯著升高(P<0.01)；與 RIRI+Prof組比較，RIRI+Prof+BAI組大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量明顯降低(P<0.05)，血清SOD活力明顯升高(P<0.05)，RIRI+Prof+ML385組大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量明顯升高(P<0.05)，血清SOD活力明顯降低(P<0.05)；與RIRI+Prof+ML385組比較，RIRI+Prof+BAI+ML385組大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量明顯降低(P<0.05)，血清SOD活力明顯升高(P<0.05)。

注：與Sham組比較，**P<0.01；與RIRI組比較，#P<0.05，##P<0.01；與RIRI+Prof組比較，& P<0.05；與RIRI+Prof+MB85組比較，△P<0.05圖5 加入Nrf2/HO-1通路抑制劑ML385后BAI聯合Prof對RIRI大鼠的影響

4 討論

由于缺血再灌注引起的腎小管損傷，尿素和Scr會重新進入血流，導致血清氮水平升高。因此，評估血清中尿素和肌酐可間接反應腎功能損傷的情況[15]。BUN、Scr水平顯著升高提示存在嚴重的腎功能損傷。劉甦等[16]研究發現，Prof通過降低BUN及Scr水平對RIRI大鼠有保護作用。本研究發現，BAI聯合Prof可降低RIRI大鼠BUN、Scr水平，改善大鼠腎組織病理損傷程度。提示BAI聯合Brof改善RIRI腎功能損傷。

當機體發生缺血再灌注損傷時，自由基、活性氧的過度堆積以及機體抗氧化能力的減弱，誘導發生氧化應激，加重RIRI[17-18]。SOD、MDA是氧化應激的重要指標。研究表明，SOD可拮抗氧化應激，與氧化應激水平呈負相關[19-20]。由于腎臟細胞膜破裂，MDA含量在腎臟缺血再灌注過程中增加[21]。本研究發現，BAI聯合Prof可升高RIRI大鼠SOD活力，降低MDA含量。提示BAI聯合Prof通過抗氧化應激改善RIRI。

細胞凋亡是一種由多種基因調控的自主程序性死亡，在RIRI病理生理過程中發揮重要作用，抑制細胞凋亡是治療RIRI的方法之一[22]。Bax和 Bcl-2 屬于Bcl-2基因家族成員，Bcl-2為凋亡抑制基因，Bax為促凋亡基因，Bax/Bcl-2水平越高，凋亡狀況越嚴重[23-24]。李錦等[25]研究發現，Prof通過抑制促凋亡蛋白Bax表達對RIRI引起的細胞凋亡具有保護作用。任應國等[26]研究發現，BAI可上調自身免疫腦脊髓炎小鼠Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達。本研究發現，BAI聯合Prof可升高RIRI大鼠腎組織Bcl-2/Bax水平。提示BAI聯合Prof抑制RIRI大鼠腎細胞凋亡。

Nrf2是調節機體抗氧化應激水平的重要基因，而HO-1作為一種抗氧化酶可以維持應激狀態下細胞的穩定性，發揮抗氧化作用[27]。當機體受到氧化應激損傷時，激活Nrf2可結合抗氧化反應元件上調HO-1的表達，從而提高機體抗氧化應激的能力[28]。當腎臟發生缺血再灌注時，激活Nrf2/HO-1通路對腎臟起到明顯保護作用[29-30]。本研究發現，BAI聯合Prof可升高RIRI大鼠p-Nrf2/Nrf2水平，上調HO-1、NQO1蛋白表達。提示BAI聯合Prof通過激活Nrf2/HO-1通路保護RIRI大鼠，加入Nrf2/HO-1通路抑制劑ML385后則逆轉這些效應證實了這一點。

綜上所述，黃芩苷聯合丙泊酚能減輕腎缺血再灌注損傷大鼠的腎組織病理損傷，其機制可能與抗氧化應激、抑制腎細胞凋亡、激活Nrf2/HO-1通路有關。