基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柴胡治療癲癇的作用機制*

盧玲，梁妮，廖現(xiàn)秋，李歡，李明芬，秦紅玲，宋曦，刁麗梅

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

癲癇(epilepsy，EP)是一種以發(fā)作性、短暫性、重復(fù)性和刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的綜合征[1]。癲癇發(fā)作可引起短暫性大腦功能障礙。該病治療周期長，但長期服用抗癲癇藥常伴有多種不良反應(yīng)，且嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[2]。據(jù)統(tǒng)計，對抗癲癇藥耐藥的難治性癲癇患者約占癲癇患者總數(shù)的1/3[3]。中醫(yī)在治療癲癇方面歷史悠久，能很好地控制癲癇患者的臨床癥狀，有效減緩發(fā)作頻率，提高患者依從性，減少抗癲癇藥的不良反應(yīng)[4]。現(xiàn)代研究及臨床實踐中發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥具有良好的抗癲癇效果[5]。

自古對于柴胡的應(yīng)用甚廣，中醫(yī)認(rèn)為柴胡性味苦寒，歸屬肝經(jīng)、膽經(jīng)、三焦經(jīng)、心胞絡(luò)，有解熱、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗癲癇、止痛、疏肝利膽、抗菌消炎等作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其主要成分有柴胡皂苷、多糖等，且具有多種生物活性和藥理作用[6]。柴胡中的柴胡皂苷可能通過減輕氧自由基的損傷程度，改善腦組織ATP酶的活性，從而起到抗驚厥和鎮(zhèn)靜作用，可緩解癲癇患者的抽搐、全身強直、凝視等癥狀[7]。然而，由于中藥治療疾病是多成分、多靶點的調(diào)節(jié)方式，使得柴胡治療癲癇的作用機制并不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于大數(shù)據(jù)時代背景下的新興學(xué)科，以疾病-基因-藥物多層次網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)以及多種網(wǎng)絡(luò)計算平臺等，能夠從整體上預(yù)測藥物靶點、提高藥物發(fā)現(xiàn)效率[8]。中藥通過多種活性成分及多種作用途徑，起到治療疾病的目的，其過程與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究過程不謀而合。何信用等[9]通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃連解毒湯治療動脈粥樣硬化的潛在分子機制。Huang等[10]通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)二至丸抗藥物性肝損傷的可能機制。眾多研究均表明，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫挖掘中藥的活性化合物及其作用靶點，進行藥物的作用機制研究具有可行性。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，構(gòu)建“成分-靶點-通路-疾病”多維網(wǎng)絡(luò)，探索柴胡治療癲癇的作用機制，為柴胡的臨床應(yīng)用以及癲癇相關(guān)的基礎(chǔ)與臨床研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象TCMSP (http：//tcmspw.com/tcmsp.php)是中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺，本研究通過TCMSP檢索獲得柴胡的全部化合物，根據(jù)建議藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)，剔除其余不符合條件的化合物，得到其活性化合物數(shù)據(jù)。

1.2 研究工具從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)中獲得柴胡的成分、靶點、相互關(guān)系和靶點的基因信息。在線文本挖掘服務(wù)器GeneCards(https：//www.genecards.org/)和人類孟德爾遺傳OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//omim.org/)中收集到與癲癇相關(guān)的靶基因。在線軟件venny2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)分析得到柴胡與癲癇共同的靶點。STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建“柴胡活性化合物-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)，并且對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化，CytoNCA 插件進行PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選核心靶點。R語言軟件(版本：v.3.5.0)的clusterProfiler包[11]對柴胡與癲癇的共同靶點進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，進一步通過Cytoscape構(gòu)建KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.3 柴胡活性化合物的篩選生物利用度(oralbioavail-ability，OB)是口服藥物的主要藥代動力學(xué)參數(shù)，用來測量藥物吸收進入血液循環(huán)系統(tǒng)的速度和程度[12]。類藥性 (drug-likeness，DL)是預(yù)測化合物成為藥物的可能性的定性原則，可用于藥物開發(fā)，幫助優(yōu)化藥代動力學(xué)和藥學(xué)特性[13]。本研究從TCMSP中檢索獲得柴胡的全部化合物，根據(jù)建議藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)：OB≥30%和DL≥0.18篩選出柴胡的活性化合物。

1.4 柴胡治療癲癇的作用靶點篩選通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出癲癇相關(guān)的靶點，剔除重復(fù)靶點，得到癲癇相關(guān)靶點數(shù)據(jù)。基于在線軟件venny2.1.0對癲癇相關(guān)靶點和柴胡作用靶點取交集，獲得柴胡和癲癇的共同靶點。

1.5 初步構(gòu)建“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)Cytoscape可用于構(gòu)建由蛋白質(zhì)、基因、藥物等相互作用構(gòu)成的分子交互網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)生物網(wǎng)絡(luò)可視化和數(shù)據(jù)集成[14]。將篩選出的化合物及靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1進行可視化分析，構(gòu)建“柴胡活性化合物-癲癇靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.6 通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治龊Y選核心靶點為了解靶點之間的相互作用關(guān)系，將柴胡和癲癇的共同靶點導(dǎo)入在線數(shù)據(jù)庫STRING進行分析，得到蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò))。并使用 Cytoscape 軟件中 CytoNCA 插件篩選核心靶點，構(gòu)建核心子網(wǎng)絡(luò)，最后將PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選的核心靶點與“柴胡活性化合物-癲癇靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進行綜合分析，得到“柴胡活性化合物-癲癇靶點-PPI核心靶點”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.7 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析將柴胡與癲癇的共同靶點導(dǎo)入R語言軟件進行GO和KEGG富集分析，該分析是基于clusterProfiler條件下進行的。clusterProfiler是Bioconductor的軟件包，可以對基因集合或基因簇進行功能聚類的統(tǒng)計分析和可視化，其內(nèi)部支持GO和KEGG[11]。本研究以Pvalue<0.05為篩選條件，選取符合條件的前20位KEGG信號通路及GO生物過程。

1.8 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建把上述分析得到的KEGG信號通路數(shù)據(jù)進行編排，構(gòu)建關(guān)系對文件，選取富集最顯著的前20位KEGG通路進行網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。并使用Cytoscape 進行可視化，計算出網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點的Degree值，并根據(jù)Degree值的大小調(diào)整節(jié)點的大小，以展示靶點與通路相關(guān)性的大小。

2 結(jié)果

2.1 柴胡中的活性化合物及靶點通過對柴胡的活性化合物篩選發(fā)現(xiàn)，柴胡中共有349個化合物，根據(jù)篩選條件：OB≥30%和DL≥0.18篩選出乙酸芳樟酯(linoleyl acetate)、黃芩苷(baicalin)、茵陳黃酮(areapillin)、山柰酚(kaempferol)、柴胡皂苷(saikosaponin c_qt)、槲皮素(quercetin)、豆甾醇(stigmasterol)、異鼠李素(isorhamnetin)等17個活性化合物。這17個活性化合物共作用于166個靶點。柴胡活性化合物基本信息見表1，柴胡活性化合物作用的部分靶點見表2。

表1 柴胡活性化合物基本信息

表2 柴胡活性化合物作用的部分靶點基本信息

2.2 “柴胡活性化合物-癲癇靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫對癲癇相關(guān)的編碼基因進行查找，獲得癲癇相關(guān)的靶點4 622個。基于在線軟件venny2.1.0對柴胡的166個藥物潛在靶點和癲癇的4 622個靶點取交集，得到108個共同的靶點，見圖1。這108個靶點既是癲癇相關(guān)的靶點，也是柴胡治療癲癇的作用靶點。將活性化合物及靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 進行可視化分析，得到“柴胡活性化合物-癲癇靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，其中淺藍色部分代表藥物和疾病的共同靶點，黃色部分代表藥物活性化合物，見圖2。

圖1 柴胡化合物靶點與癲癇相關(guān)靶點韋恩圖

注：圖中淺藍色代表柴胡和癲癇的108個共同靶點，黃色代表柴胡的17個活性化合物，紅色代表癲癇，綠色代表柴胡圖2 “柴胡活性化合物-癲癇靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選核心靶點為了解靶點之間的作用關(guān)系，將共同靶點輸入在線STRING數(shù)據(jù)庫中，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果表明，108個共同靶點之間均存在直接或間接的作用關(guān)系。同時使用CytoNCA插件進行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選出Degree值>61的靶點共12個，得到核心子網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。篩選出的12個核心靶點與柴胡活性化合物對應(yīng)關(guān)系見表3。再將PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果與前面得到的“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)進行綜合分析，構(gòu)建“柴胡活性化合物-癲癇靶點-PPI核心靶點”關(guān)系圖，其中淺藍色代表柴胡和癲癇的共同靶點，黃色代表柴胡活性化合物，粉色代表PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅?2個核心靶點，見圖4。得到的AKT1、VEGFA、IL-6、CASP3、JUN、EGF、EGFR、PTGS2、MAPK1、MAPK8、MYC、MMP9 12個核心靶點既受到柴胡活性化合物的調(diào)控，也與癲癇的發(fā)病密切相關(guān)。

表3 12個核心靶點基本信息

圖3 12個核心靶點之間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO生物過程和KEGG通路富集分析在clusterProfiler包加載后，以Pvalue<0.05為篩選條件，將藥物與疾病的共同靶點基因?qū)隦語言軟件中進行GO和KEGG分析。GO分析結(jié)果得到138個條目，再根據(jù)P值從小到大的順序，選取前20個GO分析條目。其中主要包括類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、核受體的活動(nuclear receptor activity)、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合(transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)、細胞因子活性(cytokine activity)等生物分析過程，具體GO注釋見圖5。柴胡治療癲癇作用靶點的KEGG通路富集分析結(jié)果共得到169條KEGG通路，同樣按照P值從小到大的順序篩選前20條，主要涉及糖尿病并發(fā)癥的信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、乙型肝炎通路(Hepatitis B)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、C型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)等，見圖6。除了前20條通路之外，KEGG分析結(jié)果也表明藥物與疾病的共同靶點基因在MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)和細胞凋亡通路(Apoptosis)等，癲癇發(fā)病相關(guān)的通路上也有顯著富集。

注：圖中淺藍色代表柴胡和癲癇的108個共同靶點，黃色代表柴胡活性化合物，粉色代表12個核心靶點，紅色代表癲癇，綠色代表柴胡圖4 “柴胡活性化合物-癲癇靶點-PPI核心靶點”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

注：橫坐標(biāo)代表基因數(shù)，縱坐標(biāo)代表GO條目，顏色越紅代表p值越小圖5 GO分析結(jié)果圖

2.5 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將KEGG通路富集分析得到的前20條通路數(shù)據(jù)進行編排后導(dǎo)入Cytoscape 軟件，根據(jù)Degree值的大小調(diào)整節(jié)點的大小，得到KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖7。其中共有84個節(jié)點，橙色部分代表前20個富集顯著的通路，紅色部分代表通路上富集的靶點基因，橙色節(jié)點越大代表通路上富集的靶點基因越多，紅色節(jié)點越大代表靶點基因參與的通路越多。上述PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫降腁KT1、VEGFA、IL-6、CASP3、JUN、EGF、EGFR、PTGS2、MAPK1、MAPK8、MYC、MMP9 12個核心靶點，也在KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。結(jié)果表明，柴胡的各活性化合物是通過多靶點、多信號通路共同發(fā)揮治療癲癇的作用。

注：橫坐標(biāo)代表基因數(shù)，縱坐標(biāo)代表通路名稱，顏色越紅代表p值越小圖6 KEGG通路分析結(jié)果圖

注：橙色代表通路，紅色代表靶點基因，橙色節(jié)點越大代表通路上富集的靶點基因越多，紅色節(jié)點越大代表靶點基因參與的通路越多圖7 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

癲癇即中醫(yī)所說的“癇病”，其發(fā)病通常涉及肝、脾、心、腎等臟腑。遺傳因素、勞作過度、起居失調(diào)、情志內(nèi)傷、腦部疾患皆可發(fā)為本病。柴胡具有抗驚厥、抗癲癇等作用。現(xiàn)代基礎(chǔ)研究表明，柴胡中的活性化合物柴胡皂苷具有抗驚厥、抗癲癇、抗炎等多種藥理活性，能減緩病變神經(jīng)元的興奮性，具有抑制癲癇發(fā)作，保護神經(jīng)元的作用[15]。臨床上，柴胡常應(yīng)用于治療癲癇，然而其作用機制尚不明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過對柴胡的活性化合物、靶點進行分析，發(fā)現(xiàn)不同的藥物成分可同時作用于多個靶點，初步揭示了柴胡治療癲癇的可能作用機制。

網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，柴胡中的活性化合物主要含有黃芩苷、山柰酚、柴胡皂苷、槲皮素、異鼠李素、茵陳黃酮等，其均與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)。有研究表明，黃芩苷可以明顯減輕癲癇發(fā)作所致的神經(jīng)元丟失，減輕海馬脂質(zhì)過氧化、亞硝酸鹽含量和還原型谷胱甘肽水平的變化，具有顯著的抗驚厥和神經(jīng)保護作用[16]。黃芩苷可能通過下調(diào)miR-497的表達，裂解caspase-3蛋白和上調(diào)Bcl-2的表達，進而降低癲癇后海馬神經(jīng)元的損傷和凋亡，具有較強的抗凋亡作用[17]。柴胡皂苷A能抑制4種動作電位誘發(fā)的癇樣放電，選擇性地增加瞬間失活K+電流，從而減弱海馬神經(jīng)元中的自發(fā)反復(fù)癲癇樣放電，起到抗癲癇作用[18]。Mazumder等[19]在銀杏葉提取物的研究中提取出了山柰酚、槲皮素和銀杏葉總黃酮等，并且其可通過抑制mTOR通路的過度激活，對癲癇起保護作用。本研究從柴胡中篩選的活性化合物：山柰酚、槲皮素和異鼠李素均屬于黃酮類化合物[20]。研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，黃酮類化合物與GABA受體上的苯二氮卓類藥物結(jié)合，可以保護大腦免受氧化應(yīng)激的傷害，具有抗驚厥作用，對癲癇有潛在的神經(jīng)保護作用[21]，這為進一步深入探討柴胡治療癲癇的作用機制奠定了良好的基礎(chǔ)。

PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點和KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析均顯示，柴胡中的活性化合物可能是通過AKT1、VEGFA、IL-6、CASP3、JUN、EGF、EGFR、PTGS2、MAPK1、MAPK8、MYC、MMP9等靶點起作用。VEGF在多種神經(jīng)病理過程中發(fā)揮重要作用，既往研究在耐藥性顳葉癲癇患者顳葉新皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C及其受體蛋白表達均增加，提示血管內(nèi)皮生長因子系統(tǒng)在耐藥性顳葉癲癇的發(fā)病機制中起著重要的作用[22]。在動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，通過抑制PTGS2的表達，能夠有效緩解癲癇發(fā)作[23]。同樣，細胞因子也在癲癇的病理生理過程中扮演著重要的角色。在顳葉癲癇患者中炎性細胞因子血清IL-6水平明顯升高[24]。因此，癲癇的發(fā)生與血管內(nèi)皮因子、白細胞介素、表皮生長因子以及PTGS2的表達均密切相關(guān)。充分證明了柴胡治療癲癇是多分子、多靶點、多途徑相互作用的結(jié)果。

GO分析結(jié)果主要涉及類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、核受體的活動(nuclear receptor activity)、細胞因子活性(cytokine activity)、激酶調(diào)節(jié)活性(kinase regulator activity)等過程。KEGG通路分析結(jié)果顯示，相關(guān)靶點顯著富集在流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、C型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)等。促炎因子 IL-17 的分泌失衡是藥物難治性癲癇患者重要的免疫特征，IL-17具有增加血腦屏障的通透性和神經(jīng)元興奮性的作用，這提示癲癇發(fā)作可能是由 IL-17 細胞因子的促炎作用引起的，促炎性IL-17信號通路在難治性癲癇免疫組學(xué)結(jié)構(gòu)中起著主導(dǎo)作用[25]。研究證實，HIF-1α因子和HIF-1α信號通路相關(guān)的多個基因集下調(diào)與膠質(zhì)母細胞瘤的致癇密切相關(guān)[26]。C型凝集素家族中的四聯(lián)素(Tetranectin，TN)是一種分泌型同源三聚體蛋白，被證實與多發(fā)性硬化和癲癇等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[27]。除了圖6中展示的前20條通路之外，共同靶點還富集在MAPK信號通路和細胞凋亡通路等與癲癇相關(guān)的信號通路上。研究認(rèn)為，miRNA-129可能通過抑制MAPK信號通路，從而抑制癲癇的發(fā)生發(fā)展[28]。凋亡和自噬信號通路則被認(rèn)為是由癲癇發(fā)作觸發(fā)的，都與癲癇反復(fù)發(fā)作后的神經(jīng)元丟失有關(guān)[29]。綜上，柴胡中的活性化合物可能通過參與上述通路，進而減輕炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)元細胞凋亡、減少神經(jīng)損傷等，從而發(fā)揮抗癲癇的作用。進一步說明柴胡治療癲癇是通過多種生物途徑、多條信號通路共同起作用的。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柴胡治療癲癇的作用機制，結(jié)果表明，柴胡治療癲癇是通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮作用，拓寬了柴胡臨床應(yīng)用的思路，也為中醫(yī)藥治療癲癇提供了機制研究的思路。且本研究預(yù)測的活性化合物、靶點及通路與文獻報道基本相一致，為本課題組進一步的實驗驗證提供了良好的方向。