臭氧后處理對心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用及機制研究〔1〕

余盛龍，郭惠莊，陳漢威

(1.廣州市番禺區中心醫院，廣東 廣州 511400；2.廣州市番禺區心血管疾病研究所，廣東 廣州 511400)

在我國，隨著社會人口老齡化以及人們生活方式的改變，冠心病并發缺血性心肌病的發病率呈增高趨勢，嚴重威脅人類健康。近年來，冠脈的介入治療得到了廣泛開展，但是，術后可能出現的缺血再灌注損傷也逐漸成為目前研究的熱點問題，越來越受到關注和重視。因此，尋找有效防治缺血再灌注損傷的方法具有重大意義。近年來，隨著研究的深入，人們發現臭氧(O3)能調節多種細胞的功能代謝，應用臭氧處理可以增強機體的抗氧化能力，減輕再灌注造成的損傷[1-3]。不僅在骨關節病、口腔、腫瘤等領域有較多報道，而且臭氧治療急性期腦梗死、腎臟缺血再灌注損傷等亦有一定療效。但是，迄今為止，尚無臭氧與急性心肌梗死再灌注損傷的在體基礎研究報道，即使是離體研究也較少。對于缺血再灌注損傷的防治，目前大多數研究都局限于缺血預處理，然而，缺血預處理需要在發生缺血前進行，而急性心肌梗死特點是起病的突發性和嚴重性，這就使得缺血預處理因為失去了應用的時機而價值大打折扣。針對上述問題，本研究中制作心肌細胞缺氧/復氧(H/R)模型，從細胞水平觀察臭氧后處理對H/R心肌細胞活性、細胞損傷、氧化應激、凋亡的影響，并觀察臭氧處理前后熱休克蛋白(HSP70)表達的變化以及使用HSP70抑制劑(PES)處理后對實驗結果的影響，探討臭氧后處理保護心肌細胞H/R損傷的作用機制。

1 資料與方法

1.1 培養原代心肌細胞并建立心肌細胞模擬缺血再灌注模型

培養原代心肌細胞并建立心肌細胞模擬缺血再灌注損傷(SIRI)模型：先后分離培養乳鼠心肌細胞，采用免疫熒光法對心肌細胞進行鑒定。參照文獻[4]介紹的實驗方法，模擬體內心肌細胞接受缺血再灌注損傷的過程，建立心肌細胞H/R損傷模型。

1.1.1 培養原代心肌細胞

SD乳鼠(出生24 h內)，使用75%的乙醇進行消毒，并用5%的異氟醚麻醉；在乳鼠胸骨左緣第3、4肋間處剪開胸腔，雙手配合，打開胸腔，將心臟從胸腔內取出，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗后剪除心房和右心室，保留左心室，然后冰凍切片；把心肌切片置于1 mg/mL膠原酶的羥乙基呱嗪乙硫磺酸(HEPES)緩沖液中消化，重復消化3 次，每次3～5 min；用含10%血清的改良的細胞培養基(DMEM)溶液終止消化，將細胞懸液加入到細胞過濾器中，去除較大的組織碎片；將所得細胞懸液置于培養瓶，預置2 h，消除成纖維細胞和內皮細胞；收集不黏附細胞，接種于96 孔板上，在37 ℃細胞孵箱培養72 h；采用免疫熒光法對心肌細胞進行鑒定；將心肌細胞接種到適當的細胞培養板進行后續實驗。

1.1.2 建立心肌細胞SIRI模型

使用細胞缺氧液置換培養液模擬心肌細胞SIRI過程，缺氧液配方為：NaCl 137 mmol/L，KCl 12 mmol/L，MgCl20.49，CaCl2·2H2O 0.9 mmol/L，HEPES 4 mmol/L，脫氧葡萄糖10 mmol/L，亞硫酸鈉0.75 mmol/L，乳酸鈉20 mmol/L，pH 6.5。缺氧時除了使用缺氧液，再給予94%N2，5%CO2和1%O2的混合氣體以2 L/min的流速通氣置換空氣，時間為4 h。缺氧、缺血孵化后更換新鮮培養基，并置于正常的孵箱環境(5%CO2和95%O2)，繼續孵化6 h，制成心肌細胞SIRI模型。

1.2 探索最佳的實驗臭氧濃度

實驗分為5 組：正常對照(control)組、H/R組、臭氧不同濃度(1 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L)+H/R組。應用CCK-8試劑盒(日本Dojindo Lab)檢測心肌細胞存活率；AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測心肌細胞凋亡率，評估細胞損傷情況，研究臭氧對心肌細胞H/R損傷的保護作用，確定臭氧最佳濃度。

1.3 臭氧后處理保護心肌細胞H/R損傷的作用機制

實驗分為5組：正常對照組、臭氧組、H/R組、臭氧+H/R組，臭氧+PES+H/R組。應用CCK-8試劑盒(日本Dojindo Lab)檢測心肌細胞存活率；AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測心肌細胞凋亡率；應用全自動生化儀、Elisa試劑盒檢測培養液中乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)活性。評估細胞損傷及氧化應激損傷情況。應用Western blot法檢測HSP70表達水平，探討臭氧保護心肌細胞H/R損傷的作用機制。

1.4 統計學方法

2 結 果

H/R造模后各濃度臭氧(1 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L)均可減輕心肌細胞H/R模型誘導的細胞損傷和存活率下降，其中濃度5 μmol/L效果最好(見圖1和圖2)。

圖1 各組心肌細胞存活率比較

圖2 各組心肌細胞凋亡率比較

臭氧后處理可減輕心肌細胞H/R模型誘導的損傷，與H/R組比較，臭氧+H/R組心肌細胞存活率上升，凋亡率下降，LDH活性、MDA濃度顯著降低，而SOD活性、HSP70表達水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；臭氧+PES+H/R組與臭氧+H/R組比較，心肌細胞存活率、SOD活性、HSP70表達水平均下降，而心肌細胞凋亡率、LDH活性、MDA濃度均不同程度上升，差異有統計學意義(P<0.05)(圖3～圖8)。

圖3 各組心肌細胞存活率比較

圖4 各組心肌細胞凋亡率比較

圖5 各組心肌細胞LDH活性比較

圖6 各組心肌細胞MDA濃度比較

圖7 各組心肌細胞SOD活性比較

圖8 各組心肌細胞HSP70表達水平比較

3 討 論

缺血再灌注損傷(IRI)是指缺血期處于可逆損傷的組織細胞經恢復血液再灌注后，損傷加重或轉化為不可逆性損傷[5]?！皶r間就是心肌，時間就是生命”，對于急性心肌梗死患者，既往的治療關注于盡快恢復缺血冠狀動脈的血流、盡可能縮小心肌的梗死面積。然而，再灌注治療的過程也易加重氧化應激損傷，不僅未能使組織細胞缺血性損害得到減輕或恢復，反而進一步加劇心肌細胞的損傷[6]。自從提出缺血再灌注損傷的概念以后，人們對缺血再灌注損傷的研究一直沒停止過，學者們先后提出了氧化應激、能量代謝障礙、自由基增多、鈣超載、炎癥反應、酸中毒等多種損傷機制學說[1，7]。其中，在眾多發病機制中，氧化應激在心肌缺血再灌注損傷的發生發展中起著重要作用，生理情況下機體產生的活性氧(ROS)很少，而且體內存在抗自由基氧化的防御系統，ROS的產生和清除存在動態平衡。但在某些病理情況下，機體這一平衡遭到破壞，ROS產生的速率大于被清除的速率，造成ROS蓄積。ROS有十分活潑的反應性，能與各種細胞成分發生反應，導致氧化應激的出現。因此抗氧化劑的應用在防治缺血再灌注損傷中顯得尤為重要。臭氧是氧氣的同素異形體，擁有特殊臭味，常溫、常態及常壓下，低濃度時為無色氣體，當濃度達15%以上時為藍色氣體。臭氧分子不是一個自由基分子，但它的活性要比氧活躍很多，氧化能力極強。利用外軌道帶有的成對電子，在細胞內外通過生物化學反應，生成類似ROS的物質。近年來，隨著研究的不斷深入，人們發現臭氧除了具有強大的抗氧化活性和自由基清除能力外，還有抗排斥反應、抑制炎癥反應、調節機體免疫機能、提高認知功能等功效，并廣泛應用于大腦、骨骼肌、肝臟、腎臟等器官相關疾病救治中[8]。研究[8]發現，狗心臟多次短暫的缺血可以減輕隨后較長時間的缺血再灌注帶來的心肌損傷，由此提出缺血預處理的概念。缺血預處理是在嚴重心肌缺血發生前，通過誘導反復多次短時間的非致死性缺血再灌注，以激活機體內在的保護機制，提高心肌細胞自身抗損傷的耐受性或適應性，已被許多實驗研究[9-10]證實是縮小心肌梗死面積、保護心肌細胞的有效方法。然而，缺血預處理需要在發生缺血前進行，而在實際臨床工作中，急性心肌梗死特點是急、危、重，疾病的發生往往是突發的，不可預知的，這就使缺血預處理的應用價值明顯受限。

近年來，學者們[11-12]提出了缺血后處理的概念，為缺血再灌注損傷的防治提供了一個新的思路及方向。根據缺血再灌注損傷的發病機制，后處理的作用機制涉及ROS、內源性自身激活物、線粒體ATP敏感性鉀通道、一氧化氮、再灌注損傷補救激酶途徑、線粒體通透性轉換孔等多方面作用。已有學者[13]將其應用于臨床，并取得了一定的心肌保護效果。但目前文獻報道用于模擬后處理的藥物并不多，主要有腺苷、阿片類物質、揮發性麻醉藥物等，且由于藥物本身的不良反應(如阿片類物質)或藥物本身的特點(如揮發性麻醉藥物)，使其臨床應用受到了較大限制；而腺苷只是從改善心肌細胞能量代謝方面發揮一定的作用，途徑較單一。HSP70是一種非特異性細胞保護蛋白，是HSP家族中最重要的一員，具有多種生物學功能。近年來隨著對熱休克蛋白結構和功能研究的深入，其在缺血再灌注損傷中的作用也逐漸受到重視。研究[14-15]表明，HSP70在減輕心肌缺血再灌注損傷中發揮重要的作用。本項目制作心肌細胞H/R模型，從細胞水平觀察臭氧后處理對H/R心肌細胞活性、細胞損傷、氧化應激、凋亡的影響；觀察臭氧處理前后HSP70蛋白表達的變化，探討臭氧后處理保護心肌H/R損傷的作用機制。研究結果顯示，缺氧/復氧可造成心肌細胞損傷，表明心肌H/R損傷模型構建成功；采用臭氧后處理干預H/R心肌細胞，發現臭氧具有保護心肌細胞損傷、抗氧化應激、抗凋亡的作用。同時發現，經臭氧的干預處理后，增強了HSP70的表達，而HSP70抑制劑PES可增加細胞損傷、氧化應激損傷和凋亡，減少HSP70的表達，阻斷了臭氧對心肌細胞的保護作用。因此，通過上調HSP70的表達可能是臭氧減輕心肌細胞H/R損傷的作用機制之一。