核桃青皮中多酚類物質的分離純化及其抗氧化性

李曉華

新疆石河子職業技術學院（石河子 832000）

核桃青皮，也稱青龍衣，是包裹在核桃外部的一層綠色果皮，是核桃的主要副產品之一，作為中藥材、保健品成分、食品添加劑使用[1]。核桃青皮含有鉀、鈣、鎂、鐵等多種礦質元素，并呈現高鉀低鈉的特點，含有多種揮發油和脂肪酸，具有防止血管硬化、預防高血壓和冠心病、抵御衰老和血管結石等保健功效，醫學上將其應用于抗腫瘤、抗菌的臨床應用[2-3]。由于核桃青皮的醫療保健功效優異，市場上處于供不應求的狀態，如何更加有效地提取核桃青皮中有用成分尚有待研究。

試驗旨在提取純度較高的青皮多酚類物質，通過大孔樹脂與分離純化方式的有效結合達到試驗目的，并在此基礎上研究分析青皮多酚的抗氧化性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

青皮核桃（阿克蘇溫宿縣）；大孔樹脂（杭州鑫膜實業有限公司）；無水乙醇（成都化夏化學試劑有限公司）；甲苯（蘇州誠享化學材料有限公司）；碳酸氫鈉（濟南坤豐化工有限公司）。

BSD-YX3600型立式搖床培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；LC210型高效液相色譜儀（上海儀電分析儀器有限公司）；PGZ-978型離心機（蘇州優格曼機械有限公司）；UV-2204型紫外可見分光光度計（上海析譜儀器有限公司）。

1.2 大孔樹脂的粗提取[4-5]

將極性大孔樹脂用無水乙醇浸泡至充分溶脹，用蒸餾水洗滌溶脹大孔樹脂至沒有乙醇氣味時停止。

稱取一定量干燥核桃青皮，反復幾次研碎、烘干操作，以過0.150 mm篩青皮干燥粉末為標準。向青皮粉末中倒入足量甲苯，塞緊塞子后置于搖床培養箱中，設置環境溫度35 ℃，頻率30次/min。12 h后取出，少量多次淋洗大孔樹脂緩慢吸附，至大孔樹脂滴落尾液呈淡綠色或無色時停止，用高效液相色譜儀測定吸附提取液中多酚類物質的含量。

1.3 青皮多酚的純化[6]

大孔樹脂吸附的成分中除了多酚以外，還有大量的色素和脂肪酸，為進一步提高提取純度，需對洗脫液進行再次純化。將吸附飽和的大孔樹脂濕法裝入層析柱中，無水乙醇作為洗脫液以1.0 mL/min的洗脫流速進行洗脫。洗脫液收集于錐形瓶中，緩慢滴加5%NaHCO3溶液（質量分數）至溶液約pH 6.50，離心分離沉淀物，取上清液備用。將上清液置于-20 ℃的恒溫冰箱中3 d，取出后迅速分離結晶物與上清液，重復3次冷凍分離結晶物操作后的清液即為純度較高的青皮多酚溶液。

1.4 抗氧化能力測定方法

1.4.1 抗氧化性

采用硫氰酸鐵比色法進行測定[7]。取500 mg吐溫-20和青皮多酚樣品加磷酸鉀緩沖液定容至100 mL制備青皮多酚乳濁液，以青皮多酚標準品與磷酸鉀緩沖液配制的混合液為空白對照。在一定溫度下避光培養7 d后采用硫氰酸鹽法測定其氧化程度，于波長520 nm處測其吸光度。

1.4.2 還原性

采用鐵氰酸鉀還原法測定青皮多酚的還原能力。在1.0 mL樣品溶液中滴入磷酸鹽緩沖液和鐵氰化鉀溶液，在70 ℃水浴條件下加熱30 min，加入少量的三氯乙酸溶液后靜置至室溫，補加去離子水和氯化鐵溶液，靜置一段時間后于710 nm波長處測吸光度。設置空白管為對照并調零，測定的吸光度越大則青皮多酚還原能力越強。

1.5 試驗中的其他分析測試

1.5.1 高效液相色譜分析

流動相選用無水乙醇-水體系，流動相比例3∶1。設置進樣量10 μL，流速0.5 mL/min，分離時間45 min，檢測波長356 nm，AUFs=0.02，柱溫30 ℃，色譜柱型號采用安捷倫Eclipse Plus C18（6.5 mm×300 mm）。

1.5.2 紫外可見分光光度計測定吸光度

取青皮多酚標準品，梯度配制成不同濃度的青皮多酚標準溶液，依次測定其吸光度后，繪制濃度-吸光度擬合曲線，擬合度需大于99%。對試驗提取的不同濃度青皮多酚純化液進行吸光度測定，并與擬合曲線比對，確定測定的準確度，準確度精度±5%。

2 結果與討論

2.1 青皮多酚的液相色譜分析

圖1為試驗中大孔樹脂吸附的青皮多酚液相色譜圖，圖2為分離結晶物后的青皮多酚液相色譜圖。可以看出，圖1中的物質組成成分復雜，有效的青皮多酚含量占比不超過50%，不具備過多的應用價值，應進行合適的純化處理提高青皮多酚的含量。圖2則可以很明顯發現出峰的保留時間集中在20～30 min，此區間內的物質含量總和超過80%，且與青皮多酚純品的保留時間基本一致，判定此區間內的物質成分為青皮多酚類物質（綠原酸、阿魏酸、芥子酸、兒茶素、楊梅酮、胡桃醌等），同時說明分離純化的試驗效果頗佳，達到純化要求。

圖1 大孔樹脂吸附的粗提取青皮多酚液相色譜圖

圖2 青皮多酚分離純化后的液相色譜圖

2.2 淋洗流速對大孔樹脂吸附性能的影響

不同淋洗流速條件下大孔樹脂吸附量的變化曲線如圖3所示。從總體趨勢上可以看出，淋洗流速小于3.0 mL/min時，大孔樹脂的最終吸附量比較可觀，吸附性能良好，基本符合試驗實際要求且工作效率較高。足夠的吸附量能夠提升分離純化的試驗效果，對于后續試驗結果分析有益。考慮到試驗總時長和分離的多酚含量，確定淋洗流速以2.0 mL/min為宜。

圖3 淋洗流速與大孔樹脂吸附量的關系曲線

2.3 pH對純化過程中離心沉淀物的影響

青皮多酚中的糖類物質在弱酸性條件下易與脂肪酸結合后沉降，生成酸性沉降物。青皮多酚為多元酚結構，在弱酸性條件下能保持完好的分子狀態，而堿性條件下會促進鹽結構的形成，破壞青皮多酚的活性。因而選擇弱酸性的條件有利于青皮多酚的純化。圖4為pH與離心沉淀物質量的關系曲線，過酸或過堿的環境下均能產生較多的沉淀物，青皮多酚在酸性較強的環境下結構不穩定，可能會與其他堿性有機物相結合，在堿性條件下則會生成鹽結晶。綜合考慮試驗情況，確定純化時的pH 6.50。

圖4 pH與沉淀物質量的關系曲線

2.4 青皮多酚的抗氧化性分析

2.4.1 抗氧化性和還原性

青皮多酚在一定條件下氧化可產生有機氧化物，這些氧化物能夠將Fe2+氧化成Fe3+。通過測定Fe3+與SCN—形成絡合物的吸光度可表征青皮多酚的自氧化能力，如圖5所示。

圖5 青皮多酚的抗氧化性測試曲線

隨著時間延長，吸光度增大。這表示隨著時間延長，青皮多酚的自氧化物濃度增大，氧化程度加重，所以一般情況下青皮多酚溶液應在低溫下貯存以防止其氧化而失去生物活性。

以吸光度評價還原性是表征有機物抗氧化能力的其中一項指標[9]。圖6為青皮多酚對Fe3+還原能力的關系曲線。可以看出，還原Fe3+的能力與青皮多酚濃度呈正相關，符合理論實際的同時，說明青皮多酚的抗氧化能力有限，易受到氧化物的影響。

圖6 青皮多酚的還原性測試曲線

2.4.2 青皮多酚的質量濃度-吸光度曲線

試驗純化的青皮多酚經紫外可見分光光度計檢測在625 nm波長處有最大吸收峰。根據稀釋后不同質量濃度青皮多酚所測定的吸光度A，可繪制出質量濃度-吸光度擬合曲線。如圖7所示，在一定的濃度范圍內，濃度與吸光度之間呈線性關系，即青皮多酚質量濃度的增大對應相應吸光度亦會增大，青皮多酚的質量濃度與其吸光度呈正比，又因質量濃度與其抗氧化性呈正比，進而推出青皮多酚的抗氧化性與吸光度呈正比。

圖7 青皮多酚的質量濃度-吸光度擬合曲線

3 結論

以青皮核桃為原料，對粗碎烘干的核桃青皮溶解液采用大孔樹脂初次提取，洗脫大孔樹脂吸附液后，離心分離沉淀物和多次低溫結晶純化所得青皮多酚類物質上清液。對影響初提取的淋洗流速因素和影響純化過程的pH因素進行探討分析，結果發現低淋洗流速有助于獲得足夠的青皮多酚提取液，確定淋洗流速2.0 mL/min適宜，而pH的過酸或過堿環境下產生較多的沉淀物會影響實際提取到的青皮多酚含量，經過綜合考慮確定pH 6.50。用高效液相色譜測定提取液中的青皮多酚含量，將粗提取液與純化液對比之后發現，試驗的純化過程比較有效，能夠將青皮多酚類物質純度提升至80%以上。試驗還對青皮多酚的抗氧化性在抗氧化和還原性2個方面進行探討，結果發現青皮多酚的自氧化物會隨著時間延長而增多，體現為所測得的吸光度增大。同時，還原性測定顯示青皮多酚的抗氧化能力有限，正常情況下需低溫條件下貯存以防止自氧化。試驗分離純化青皮多酚的試驗過程效果良好，并能在一定程度上論證青皮多酚的弱抗氧化能力。