酶輔助發酵生產右旋糖酐

常國煒，梁達奉，柳穎，黎志德，張九花

廣東省科學院生物工程研究所，中國輕工業甘蔗制糖工程技術研究中心，廣東省酶制劑與生物催化工程技術研究中心（廣州 510316）

右旋糖酐是由某些微生物（如腸膜明串珠菌，Leuconostoc mesenteroides）發酵蔗糖產生的聚D-葡萄糖，其合成機理是微生物分泌右旋糖酐蔗糖酶（EC 2.4.1.5）催化蔗糖生成右旋糖酐和副產物果糖，是一條經典的蔗糖深加工路徑[1]。不同分子質量的右旋糖酐有不同的應用[2]，但都不乏在食品方面的應用[3-9]，其中分子質量在千和萬數量級的右旋糖酐（以下稱為低分子質量右旋糖酐）具有益生元作用[10]。低分子質量右旋糖酐傳統發酵生產的發酵效率低，目標產物比例不高，常伴有大量分子質量更高的右旋糖酐，因此發酵后需高溫酸解大分子質量右旋糖酐，提高目標產物比例后再用氫氧化鈉中和。“發酵-酸解-中和”三步法工藝不僅耗費大量危險化學品，還使體系引入氯離子和鈉離子，增加純化難度；酸解過程需保持高溫，對設備要求高、損耗大、能耗高。針對該工藝，已有不同的改進方案，利用右旋糖酐酶（EC 3.2.1.11）酶解代替鹽酸酸解[11]，可形成“發酵-酶解”二步法工藝，在一定程度上優化了流程，但未能解決發酵效率低的問題；利用酶法合成低分子質量右旋糖酐[12-14]，但已脫離傳統發酵生產范疇，企業改造和應用成本較高。在發酵過程中添加右旋糖酐酶輔助發酵，形成“酶輔助發酵”一步法工藝，極大地優化流程，同時達到提高發酵效率和目標產物比例的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸膜明串珠菌（編號GIM1.473，廣東省微生物菌種保藏中心）；右旋糖酐酶酶液（酶活2.053×104U/mL，廣東省科學院生物工程研究所提供）；右旋糖酐分子質量標準品（American Polymer Standards Corporation）；蔗糖、果糖、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、無水硫酸鈉、疊氮化鈉（國產分析純）；細菌學蛋白胨（國產生化試劑）。

1.2 設備與儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本SHIMADZU）；Shodex SUGAR KS-803、ShodexOHpak SB-806M HQ高效液相色譜填充柱（日本昭和電工株式會社）；GRJB-5D發酵系統（鎮江格瑞生物工程有限公司）；等。

1.3 傳統發酵和酶輔助發酵的對比

1.3.1 傳統發酵操作

培養基：配制含蔗糖、細菌學蛋白胨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀分別為13，0.2，0.14和0.03 g/dL的溶液。

一級種子液：將40 mL培養基倒入100 mL三角瓶中，于121 ℃、20 min滅菌。接兩環斜面上的菌種到三角瓶中，在搖床中培養48 h。培養條件：轉速100 r/min、溫度26 ℃。得到一級種子液。

二級種子液：將360 mL培養基倒入500 mL三角瓶中，按照以上步驟滅菌。將一級種子液倒入三角瓶中，在搖床中培養24 h，培養條件：轉速100 r/min、溫度26 ℃。得到二級種子液。

傳統發酵：將3.6 L培養基倒入發酵罐中，于121℃、20 min滅菌。將二級種子液倒入發酵罐中，轉速100 r/min，以0.5 mol/L NaOH溶液作為酸堿調節液，控制pH 6.5。發酵過程適時取樣，按1.3.3測定蔗糖和果糖含量、醇沉物量、發酵液黏度以及右旋糖酐分子質量分布等指標。結束發酵的標志為蔗糖轉化率超過90%。

1.3.2 酶輔助發酵操作

培養基、一級種子液、二級種子液同1.3.1小節。酶輔助發酵：在發酵至12 h時，加入一定量右旋糖酐酶酶液，其余操作同1.3.1小節。

1.3.3 分析方法

1.3.3.1 蔗糖、果糖的測定

將蔗糖和果糖置于96 ℃烘箱中干燥2 h[15]，用超純水配制質量濃度分別為0.6，1.2，1.8，2.4和3.0 g/dL的蔗糖和果糖溶液，用液相色譜進行測定，色譜條件：以經0.45 μm膜過濾的超純水為流動相；Shodex SUGAR KS-803色譜柱；柱溫50 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測器為示差折光檢測器。以峰高對濃度制得標準曲線的線性回歸方程（過原點）。蔗糖標曲為h=70191c，R2＞0.9999；果糖標曲為h=61006c，R2＞0.9999。

將發酵液稀釋適當倍數（V/V），經0.45 μm膜過濾后按上述條件進行液相色譜分析，通過標準曲線和稀釋倍數計算出蔗糖、果糖含量。

1.3.3.2 醇沉物質量的測定

取3 mL發酵液，加入6 mL無水乙醇，劇烈振蕩后，以8000 r/min離心5 min，棄上清液，用濾紙輕輕吸干管內壁和沉淀表面液體，得出醇沉物的質量。

1.3.3.3 黏度的測定

加入發酵液至10 mL ep管的管口，倒置ep管使液體流出，待液體流出至10 s無液滴滴出，測得殘留在管內的液體質量，用該質量代表發酵液黏稠程度。設定：小于0.08 g，為低黏度；0.08～0.24 g，為中黏度；大于0.24 g，為高黏度。

1.3.3.4 右旋糖酐分子質量分布的測定

測定方法為高效液相色譜法，具體步驟和條件參照文獻[16]。所用色譜柱為Shodex OHpak SB-806M HQ色譜柱，理論板數計算公式見式1（源于色譜柱使用說明書）。經試驗，得出理論板數為N=5.54×（21.300÷0.494）2=10299＞5000，說明柱子效能正常，可用于右旋糖酐分子質量測定。分子質量標準品選用720000，95000，53000和43000 g/mol，得到分子質量標準曲線lgMW=-0.6857tR+16.80。用兩倍濃度的流動相稀釋發酵液2倍后進行測定。

式中：N為理論板數；tR為出峰時間，min；W為半峰寬度，min。

1.4 酶輔助發酵不同加酶方案對產物的影響

酶輔助發酵操作按1.3.2小節進行，其中加酶方案按表1進行；右旋糖酐分子質量分布的測定按1.3.3.4小節進行。

表1 酶輔助發酵不同加酶方案 單位：μL

2 結果與討論

2.1 傳統發酵和酶輔助發酵的對比分析

由圖1～圖3可知，兩種發酵工藝前12 h的情況是相同的。前10 h蔗糖含量變化不大，蔗糖轉化率處于較低水平（約5%），果糖和醇沉物量也沒有明顯變化，說明各主要成分均無明顯變化，是典型的微生物生長遲緩期。到了12 h，蔗糖轉化率提高至11.9%，說明在10～12 h，碳源利用速度加快。此時果糖和醇沉物量仍無明顯變化，可能是因為碳源主要用于菌體生長繁殖，用于合成右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶未大量分泌，所以右旋糖酐未被大量合成，副產物果糖未大量生成。前12 h的發酵液黏度處于低黏度階段（如表2所示），因為菌體和右旋糖酐的含量均較低，此時黏度主要來源應是蔗糖。

圖1 兩種工藝蔗糖轉化率對比

圖2 兩種工藝果糖增量

圖3 兩種工藝醇沉物質量對比

兩種發酵工藝主要區別在發酵12 h后。通過圖2和圖3可知，傳統發酵至14 h，果糖量和醇沉物量有明顯上升，說明右旋糖酐開始被大量合成。從蔗糖加速消耗至果糖、醇沉物量明顯上升有約2 h的時間差，這可認為是微生物從生長遲緩期慢慢進入酶系活躍、代謝旺盛的對數生長期的轉變特征。與此同時，發酵液黏度增加到中等黏度。

發酵至20 h，蔗糖轉化率達50%，醇沉物量和果糖量不斷增大，意味著右旋糖酐含量不斷增大。在取樣過程中可明顯感到流動性變差，進行實驗操作時，難以使用如移液管、移液槍等工具準確量取體積，發酵液黏度達到了高黏度階段。到了28 h，蔗糖轉化率達89.6%，從圖1可看出蔗糖轉化開始減慢；到29 h，蔗糖轉化率達91.2%，結束發酵，估算出蔗糖轉化率達90%的時間約28.3 h。根據果糖增量可以計算出結束發酵時右旋糖酐產量（數據見表2），此時產物與底物比（發酵結束時的右旋糖酐生成量：蔗糖消耗量）為37.83%（理想最大值為47.37%，即蔗糖全部用于合成右旋糖酐）。

上述過程是傳統發酵的情況，而酶輔助發酵則是在12 h添加右旋糖酐酶，其直接作用的是水解發酵體系中的右旋糖酐的α-1,6糖苷鍵，降低其分子質量。由圖1和圖2可知，在12 h后，酶輔助發酵蔗糖轉化率和果糖增速明顯高于傳統發酵，達90%的時間僅用25.0 h，比傳統發酵縮短3.3 h，即發酵周期縮短11.7%。通過表2可知，酶輔助發酵的低黏度期延長了6 h，并將中黏度期延長至發酵結束；在12～24 h，酶輔助發酵的蔗糖消耗速率和果糖增長速率分別提高了21.4%和18.2%；右旋糖酐產量提高了3.5%；產物與底物比增加2.64個百分點，至40.47%。綜上分析，酶輔助發酵由于右旋糖酐酶作用，使右旋糖酐分子質量下降，發酵體系黏度降低，改善了發酵環境，提高了底物利用效率和產物生成效率。

表2 兩種發酵工藝數據對比

從圖3可知，發酵25 h時，兩個工藝醇沉物量相差不大，是由于1.3.3.2小節所用的乙醇量不大，比例為1∶2（發酵液∶無水乙醇），且沉淀時間較短，這均不利于低分子質量右旋糖酐沉淀析出。所以看似相近的數據，實際上酶輔助發酵的右旋糖酐量應該更多。

2.2 傳統發酵和酶輔助發酵產物分子質量分布對比

表3詳細地列出了不同發酵工藝和加酶方案發酵結束時產物分子質量分布情況，不同數量級的比例為高效液相色譜圖中對應保留時間區間積分面積的比例，表3中所有數據均沒有將百級的產物納入統計和計算。傳統發酵所得右旋糖酐分布極分散，最高達千萬級。低分子質量右旋糖酐比例只有54.2%，還有45.8%的大分子質量右旋糖酐，這部分右旋糖酐發酵液黏度增大，影響發酵效率，且不僅無法直接利用，還需要通過“酸解-中和”工序或“酶解”工序進行水解來提高目標產物比例，所需水解條件較強[17]。

表3 各工藝產物分子質量分布

酶輔助發酵中，右旋糖酐酶添加量僅為每升發酵液幾至十幾微升酶液，發酵結束時目標產物比例上升至86%～99%，僅含比例不高的十萬級右旋糖酐，分散系數從74.96下降至5以下，效果極顯著。根據式（2）可以計算出右旋糖酐酶的有效水解數，不同方案的有效水解效率有所差異，均值為0.0238×10-3NA/（h·μL酶液），該數據可指導酶輔助發酵加酶量控制。

式中：n為有效水解數；NA為阿伏伽德羅常量；m為右旋糖酐質量，g；M1為水解前右旋糖酐數均分子質量，g/mol；M2為水解后右旋糖酐數均分子質量，g/mol；18為水的摩爾質量，g/mol。

根據方案2和方案4的數據可知，在一次加酶輔助發酵基礎上，在24 h再次加入酶液，可形成二次加酶輔助發酵工藝。通過有效水解數可計算出，二次加酶輔助發酵工藝最后1 h平均酶解效率達0.112×10-3NA/（h·μL酶液），是一次加酶輔助發酵的4.7倍，說明該工藝可在結束發酵前1 h進一步調節右旋糖酐分子質量分布，為生產帶來一定的靈活性。綜上，酶輔助發酵僅需極少量右旋糖酐酶液，就能顯著提高目標產物比例，大幅降低分散系數，使產物分子質量更加集中，并可通過多次加酶靈活調節產物分子質量分布。

3 結論

在發酵生產低分子質量右旋糖酐過程中，添加極少量右旋糖酐酶，可形成“酶輔助發酵”工藝。酶輔助發酵中，右旋糖酐酶能高效水解大分子質量右旋糖酐，降低發酵液黏度，改善發酵環境，從而提高發酵效率，使蔗糖轉化率達90%的發酵周期比傳統發酵縮短11.7%，右旋糖酐產量提高3.5%，目標產物比例提高至90%以上，且分布集中。多次加酶輔助發酵還可靈活控制產物分子質量分布。酶輔助發酵省去傳統發酵后續的酸解和中和工段，極大地優化流程，達到節能減排的目的。