大別山野菊花揮發油的成分及抗菌活性

余科義，薄新黨，王文輝

河南應用技術職業學院（鄭州 450042）

野菊（Chrysanthemum indicumL.）是菊科多年生草本植物，常生長在原野、田邊，在中國的東北部及西南地區最為常見，資源豐富。野菊花是野菊的球形頭狀花序，呈棕黃色，其性味苦辛，微寒，具有疏風散熱、瀉火平肝、清熱解毒的功效[1]，可用作中藥、清涼飲品、藥枕等，夏桑菊顆粒、感冒靈顆粒等復方藥物中均含有野菊花成分。野菊花含有黃酮類、揮發油類、萜類、苯丙素類、甾醇類、蒽醌類等多種化學成分[2-7]，其中黃酮類、揮發油類和萜類含量較高，也是起藥效作用的主要成分。野菊花的提取物還具有抑菌[8-9]、消炎鎮痛[10-11]、解毒[12]、抗氧化[13-15]、抗腫瘤[16-17]等多種生物活性。在現代醫學中野菊花可以用于預防治療感冒，治療肝炎、高血壓、高血脂、濕疹、呼吸道感染等癥狀[18-20]。野菊花揮發油通常采用水蒸氣蒸餾法提取，提取率在2.0%左右[21]，有160余種化合物從揮發油中分離出來[22]，以倍半萜類、單萜類及其含氧衍生物為主要成分[23-24]。α-姜黃素、β-半水芹烯和樟腦是中國產野菊花揮發油的主要成分[25]，菊酮、1,8-桉油醇和α-蒎烯是韓國產野菊花的主要成分[23]。國產野菊花因產地不同，主要成分和含量也有所不同，活性也存在一定差別。試驗對大別山地區產野菊花的揮發油開展研究，并初步探究其對4種常見致病菌的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

野菊花采（摘自河南省信陽市大別山山區，為野菊的頭狀花序）。

吐溫-80（食品級）；瓊脂（食品級）；阿莫西林（分析純）；其余試劑為化學純。

1.2 菌株

菌種（菌種批號20190918，分別為大腸埃希菌（Escherichia coli），菌種編號CMCC（B）44102，青島日水生物技術有限公司）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，菌種編號CMCC（B）26003）；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，菌種編號CMCC（B）10104）；糞腸球菌（Enterococcus faecalis，菌種編號CMCC（B）29212）。

1.3 儀器與設備

QP-2010PLUS型島津氣質聯用儀（日本島津儀器設備有限公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；CS-700型超帥高速多功能粉碎機（武義海納電器有限公司）；KQ-800KDE型高功率數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2004N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；HT-350B型恒溫培養箱（常州市金城春蘭實驗儀器廠）；XFS-280A型壓力蒸汽滅菌鍋（紹興市景邁儀器設備有限公司）；超凈工作臺（河南貝亞生物科技有限公司）；恒溫培養箱（鄭州鑫爾瑞化驗用品有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 野菊花揮發油的提取

利用超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取野菊花的揮發油。將干燥的野菊花用粉碎機進行粉碎，過0.300 mm孔徑篩，稱取40 g粉末，按固液比1∶8（g/mL）的比例加入一定量的去離子水于500 mL單頸燒瓶中，封口，充分浸泡16 h，在100 W功率下超聲破碎處理30 min，將燒瓶放入120 ℃恒溫油浴鍋中，在磁子攪拌下蒸餾提取8 h。停止加熱，自然冷卻一段時間，收集揮發油，加入少量無水硫酸鈉進行干燥，將干燥后的揮發油用移液管轉移到另一個干凈的錐形瓶中，貼上標簽，用保鮮膜封口，置于4 ℃冷藏室保存備用。

1.4.2 野菊花揮發油成分GC-MS分析

1.4.2.1 氣相色譜（GC）條件

色譜柱RXI-SiL-MS（30 m×250 μm×0.25 μm），載氣采用高純氦氣（99.999%），進樣口溫度250 ℃，載流量2 mL/min，分流比2∶1，進樣量1 μL。

1.4.2.2 程序升溫

升溫程序：柱溫45 ℃，保持1 min，以3 ℃/min速率升溫至120 ℃，保持5 min，以5 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持10 min。

1.4.2.3 質譜（MS）條件

電子轟擊EI為電離源，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，電離能量70 eV，質量掃描范圍為m/z35～500，間隔0.2 s。

1.4.3 野菊花揮發油抗菌活性檢測

1.4.3.1 培養基的制備

配制牛肉膏蛋白胨液體培養基，加入吐溫-80，制成含1%吐溫-80的牛肉膏蛋白胨液體培養基，分裝于三角瓶中，于121 ℃滅菌30 min，于4 ℃冷藏備用。

1.4.3.2 固體平板的制備

配制牛肉膏蛋白胨液體培養基，加入凝固劑瓊脂（瓊脂質量分數1.5%），制成固體培養基，于121 ℃滅菌30 min，倒入滅菌的培養皿中制成平板，冷卻至常溫，于4 ℃冷藏備用。

1.4.3.3 菌懸液的制備

將菌種接種到斜面培養基上，于37±1 ℃培養18～24 h，取出后加入無菌生理鹽水，用接種環刮下菌苔，制成菌懸液，于4 ℃冷藏備用。

1.4.3.4 野菊花揮發油乳濁液的配制

將野菊花揮發油用含1%吐溫-80的牛肉膏蛋白胨液體培養基溶解，制成質量濃度32 mg/mL的待檢樣品溶液，滅菌后于4 ℃冷藏，作為待測樣品備用。

1.4.3.5 最低抑菌濃度（MIC）的測定

采用連續稀釋法測試野菊花揮發油的抑菌效果。取11支無菌試管（20 mm×300 mm），編號分別為1～8、陰性對照、陽性對照、空白對照。1～8號管分別加入4 mL肉膏蛋白胨培養基，取4 mL的待檢樣品加入1號管中，混勻后從中取出4 mL加入2號管中，混勻后從中取出4 mL加入3號管中，以此類推稀釋至8號管，從8號管取出4 mL溶液。1～8號管中都是4 mL待檢樣品溶液，濃度依次為C0×（1/21），C0×（1/22），…，C0×（1/28）（C0=16 mg/mL），用無菌微量移液器分別移取0.1 mL菌懸液于1～8號管中。用液體培養基配制4 mL 0.85 mg/mL阿莫西林（AM）溶液，加入0.1 mL菌懸液，作為陽性對照組。以加有0.1 mL菌懸液的4 mL培養基作為陰性對照組。以4 mL培養基為空白對照組。將11支試管共同放入37±1 ℃恒溫箱培養24 h后，根據文獻[26]報道的方法，肉眼觀察濁度以確定樣品的抑菌效果，MIC值是不顯示濁度的藥液濃度。開展4次平行試驗，取平均值。試驗過程如表1所示。

表1 野菊花揮發油抑菌試驗測定過程

1.4.3.6 最低殺菌濃度（MBC）的測定

根據MIC的試驗結果，對有抑制作用的菌組采用平板涂布法進行MBC的測定。采取上述1.4.3.5相同的方法，用培養基配制6組4 mL不同濃度的待測樣品溶液（編號為Ⅰ～Ⅵ），加入0.1 mL菌懸液（有抑菌效果的菌組）進行固體平板涂布培養。以涂布有0.1 mL菌懸液的4 mL培養基作為陽性對照組，以4 mL培養基為空白對照組。上述試驗樣品共同放入37±1 ℃恒溫箱培養24 h，觀測菌落生長情況，以沒有菌落生長的最低藥液濃度為MBC值。做4次平行試驗，取平均值。

2 結果與分析

2.1 野菊花揮發油成分分析結果

按照1.4.1的方法提取的野菊花揮發油呈淡黃色液體，具有菊花芳香氣味。做5次平行試驗，揮發油提取率相對穩定，為0.4110%±0.005%（W/W）。通過GC-MS聯用技術獲得總離子流圖（見圖1），經質譜掃描后獲得各峰的質譜圖，通過質譜庫NIST08中數據匹配檢索，并結合保留指數和文獻報道共同進行定性分析，共鑒定出化合物48種，按峰面積歸一化法計算各成分的質量分數，結果見表2。

圖1 野菊花揮發油總離子流

由表2可知，在鑒定出的48個化合物中，質量分數最高的3種物質分別是順式馬鞭草烯醇（15.81%）、廣藿香烷（11.55%）和十烷酮（10.21%），質量分數均大于10%，占總質量分數的37.57%。此外，2,6,6-三甲基-3-（2-丙烯基）二環[3,1,1]庚烷、4-亞甲基-1-甲基-2-（2-甲基-1-丙烯基）-1-乙烯基環庚烷、氧化石竹烯、9-十八碳烯-12-炔酸甲酯、1,5-二甲基-3-羥基-8-（1-亞甲基-2-羥乙基）二環[4.4.0]癸-5-烯、（E）-β-金合歡烯等成分的質量分數在3%以上。

表2 野菊花揮發油化學成分

2.2 抑菌活性試驗結果

采用連續稀釋法測試野菊花揮發油對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌的抑菌效果，試驗結果如表3所示。

表3 野菊花揮發油抑菌試驗結果

結果表明，野菊花揮發油對金黃色葡萄球菌有較強的抑制活性，對糞腸球菌的生長有一定的抑制作用，MIC分別為1 mg/mL和4 mg/mL。但對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌沒有發現有抑制活性。

2.3 殺菌活性試驗結果

因為野菊花揮發油對金黃色葡萄球菌和糞腸球菌有抑制作用，用固體平板涂布法測定野菊花揮發油對這2種菌組的最低殺菌濃度（MBC），試驗方法見1.4.3.6，試驗結果如表4所示。

分析表4的結果可以得出，野菊花揮發油對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌最低殺菌濃度（MBC）分別為2 mg/mL和6 mg/mL，對金黃色葡萄球菌具有較強的殺菌活性。試驗測得的大別山野菊花揮發油抑制金黃葡萄球菌的活性高于鐘靈允等[8]測得成都地區野菊花揮發油的活性（MIC值為2 mg/mL，MBC值為2.5 mg/mL）。

表4 野菊花揮發油殺菌試驗結果

3 結論

野菊花是傳統中草藥，具有清熱解毒、疏風散熱、散瘀、明目和降血壓之功效，可作飲品，還可以用于牙膏、藥皂等日用品，是藥食兩用植物。試驗以大別山地區產野菊花為研究對象，采用超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取野菊花揮發油，在固液比1∶8（g/mL）、功率100 W、超聲時間30 min、蒸餾溫度130℃、蒸餾時間8 h條件下，野菊花揮發油的提取率為0.4110%±0.005%（W/W）。利用GC-MS聯用技術鑒定出野菊花揮發油的48種化學成分，主要為萜類、脂肪族類化合物和萜類衍生物，其中，順式馬鞭草烯醇（cis-verbenol）、廣藿香烷（patchoulane）和十烷酮（1-decalone）的質量分數較高（＞10%）。抗菌活測定結果表明，野菊花揮發油對金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌活性，其MIC和MBC別為1 mg/mL和2 mg/mL，對糞腸球菌有一定的抑制作用，其MIC和MBC別為4 mg/mL和6 mg/mL，但對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌沒有抑制活性。野菊花揮發油的抗菌活性可能是其主要成分（馬鞭草烯醇、廣藿香烷和十烷酮）發揮作用，但需要進一步研究確定。揮發油是野菊花重要的藥效組分，其抗菌活性展現出其在醫藥領域的重要應用地位，具有很好的開發利用價值。