黑曲霉發酵蝦皮制備鈣肽絡合物膠囊

鄒漢鵬，劉漢文，路旺旺，穆立坤

鹽城工學院 海洋與生物工程學院（鹽城 224000）

蝦皮為毛蝦干制品，蛋白質質量分數為39.2%，還含有氨基酸、低肽、核苷酸等魚貝類風味相關物質[1]；礦物質蘊含豐富，其中鈣元素占2%，故素有“鈣庫”之稱[2]。中國營養協會推薦成人每日鈣攝入量應在800～1000 mg[3-4]。國民鈣攝入量普遍偏低，第三次營養調查結果顯示，我國人均每日鈣攝入量僅為400 mg，未達推薦量的50%[3-4]。近年來國內補鈣產品越來越多，銷量也在不斷增加，可是國民缺鈣的狀況依然沒有顯著改善，主要原因是鈣不能被有效利用。鈣在人體內主要通過腸道吸收，其中大腸吸收的鈣為總吸收鈣的10%，小腸吸收90%。小腸環境呈堿性，鈣離子會同小腸內的陰離子形成難溶性的鈣鹽，從而被直接排出體外，難以被吸收利用。蝦皮中的鈣含量豐富，但存在形式主要是碳磷酸鈣，傳統的食用方法蝦皮中的鈣并不能很好地被人體吸收利用。利用黑曲霉將蝦皮在一定條件下發酵，蛋白質水解為促鈣吸收肽，無機碳磷酸鈣中鈣的游離及被活化成鈣肽絡合物，鈣肽絡合物能以整體形式被小腸吸收，防止鈣元素在腸道變成不溶性化合物[5-7]，生物利用率大大提高，并且微膠囊化后的肽鈣絡合物膠囊可以大大提高蝦皮補鈣價值[8]，進一步提高產品的實用性能，可作為日常補鈣用品。這也為水產食品提質增效尋找了有益途徑。

1 材料與試驗方法

1.1 試驗材料與試劑

毛蝦蝦皮，市售；麩皮，購于鹽城面粉公司；黑曲霉，實驗室培養。

氫氧化鉀、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、鄰-甲酚酞絡合酮、乙醇胺、硼酸、8-羥基喹啉、95%乙醇、冰醋酸、無水乙醇、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鈉等；卵磷脂、蛋白胨、瓊脂、酵母浸出膏。

1.2 試驗儀器與設備

JA203P電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；XFB-200高速多功能粉碎機，永康市久品工貿有限公司；SPX-150數顯生化培養箱，江蘇金壇市億通電子有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學技術儀器設備有限責任公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋，濟南鑫貝西生物技術有限公司；UV2100紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DHG-9023A臺式電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；QFN-8000S小型噴霧干燥機，上海喬楓實業有限公司；JW-40超聲波清洗槽。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基的制備與黑曲霉的培養

采用改良馬丁瓊脂培養基。在無菌操作條件下，制備斜面培養基，用接種環將黑曲霉接種到斜面培養基上，在生化培養箱中37 ℃培養5 d，備用。

1.3.2 蝦皮黑曲霉發酵

將蝦皮浸泡、洗凈，再將其烘干、粉碎，稱量后，將蝦皮樣品倒入培養皿中搖勻，用牛皮紙密封并包裹，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，然后取出冷卻。在無菌操作條件下接入1.3.1小節斜面培養的黑曲霉，在設定的工藝條件下，置于生化恒溫培養箱中培養一定的時間，分別取出1 g發酵物加入50 mL蒸餾水，于50 ℃恒溫水浴1 h，用蒸餾水定容到100 mL，取出部分上清液，按10000 r/min離心15 min，分別測定可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量[9]。

1.3.3 可溶性鈣質量分數的測定1.3.3.1 鈣標準曲線的繪制

用鄰-甲酚酞絡合酮比色法[9-11]，以570 nm吸光度為橫坐標，可溶性鈣質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。如圖1所示。

式中：Y為每100 g（干重）蝦皮中可溶性鈣質量分數，mg/100 g；K為樣品稀釋倍數；A為吸光度；X1為麩皮添加量，%；X2為水分含量，%。

1.3.4 可溶性鈣結合量的測定

測定方法參照文獻[12-14]的試驗方法，取1 mL離心液，測定吸光度，用1.3.3小節計算可溶性鈣結合量。

1.3.5 鈣肽得率的測定

稱取一定量的發酵產物，用等質量的蒸餾水溶解，離心分離，向分離后的上清液中加入無水乙醇，充分振蕩，靜置15 min后，按10000 r/min離心15 min，將所得沉淀物烘干、稱重，計算鈣肽得率[15]。

式中：M1為醇沉淀鈣肽質量，g；M0為發酵產物質量，g。

1.4 鈣肽絡合物微膠囊化

稱取2.000 g卵磷脂粉末于三角瓶中，加入10 mL 95%乙醇潤濕，分散卵磷脂，再加入20 mL蒸餾水，充分攪拌，形成卵磷脂乳狀液。稱取3.000 g蝦皮鈣肽絡合物于燒杯中，加入20 mL蒸餾水，充分攪拌后加入到上面配制好的卵磷脂乳狀液中，攪拌均勻，于20℃水浴中超聲處理20 min，然后噴霧干燥。噴霧干燥器設置：進料泵速7 r/min，進口溫度140 ℃。

2 結果與討論

2.1 預試驗結論

在蝦皮中加入面粉、麩皮、蔗糖、葡萄糖等進行的黑曲霉生長的預試驗發現：加入面粉會使試樣出現結團現象，不利于黑曲霉的生長；加入蔗糖和葡萄糖時，試樣中黑曲霉生長較快；加入麩皮時，黑曲霉生長好，同時試樣比較松散，黑曲霉的生長不受試樣的影響。相對于蔗糖和葡萄糖，麩皮價格較低且來源廣泛。因此，黑曲霉發酵蝦皮制備鈣肽絡合物選用添加麩皮作為輔料。

2.2 麩皮添加量對可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量的影響

分別向加有等量蝦皮的發酵培養基中添加0，5%，10%，15%，20%和25%的麩皮，控制發酵溫度37 ℃、水分50%、發酵時長5 d。測定發酵試樣中可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量，結果如圖2所示。總體上看，可溶性鈣質量分數一直高于可溶性鈣結合量，符合預期。當麩皮添加量為0時，可溶性鈣質量分數、可溶性鈣結合量均較低；隨著麩皮添加量的增加，可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量也逐漸增加。當麩皮添加量達到20%時，可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量達到最高，而更高的麩皮添加量并未使可溶性鈣質量分數、可溶性鈣結合量明顯升高。其原因在于黑曲霉發酵蝦皮的過程中，含有豐富的碳水化合物和酶系的麩皮為黑曲霉發酵提供了所需的能源和碳源，使得黑曲霉的生長代謝旺盛。當麩皮添加量達到一定限值時，其酶的作用達到了最大值，所以更多的麩皮添加量并不能使酶的作用進一步提高，因此發酵過程中形成的游離性的鈣離子質量分數和可溶性鈣結合量均不再明顯增加。經反復試驗，確定麩皮的添加量為20%。

圖2 麩皮添加量對可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量的影響

2.3 溫度對可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量的影響

溫度對黑曲霉生長有著很大的影響，適宜的溫度有益于黑曲霉的生長繁殖，反之則使黑曲霉生長滯后或者大量死亡。黑曲霉的最適生長溫度為37 ℃。根據黑曲霉適合生長與產酶的條件，控制麩皮添加量20%、水分50%、發酵時間5 d，控制發酵溫度在33，35，37，39和41 ℃，測定樣品中可溶性鈣質量分數、可溶性鈣結合量。由圖3可見，溫度在37 ℃時，可溶性鈣含量、可溶性鈣結合量最高。經過驗證，將發酵溫度設定為37 ℃。

圖3 溫度對可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量的影響

2.4 水分對可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量的影響

水分影響黑曲霉生長環境的相對濕度和透氣性，因此黑曲霉的生長受到水分的影響。根據黑曲霉適合生長與產酶的條件，設定麩皮添加量20%、發酵溫度37℃、發酵時間5 d，控制水分在40%，45%，50%，55%和60%，測定樣品中可溶性鈣質量分數、可溶性鈣結合量。由圖4可見，當水分含量較低時，可溶性鈣質量分數、可溶性鈣結合量明顯較低，原因可能是在較低的水分下，發酵環境干燥、濕度不適宜，影響了黑曲霉的生長和產酶。當水分達到50%時，可溶性鈣質量分數、可溶性鈣結合量含量最高。當水分含量高于50%，隨著水分的增加，可溶性鈣質量分數、可溶性鈣結合量均降低，其原因可能是在過高的水分下，發酵環境透氣性降低，影響了黑曲霉生長與產酶。

圖4 水分對可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量的影響

2.5 發酵時間對可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量的影響

設定麩皮添加量20%、發酵溫度37 ℃、水分50%，發酵時間控制在3，4，5，6和7 d，測定樣品中可溶性鈣質量分數、可溶性鈣結合量。如圖5所示，發酵1～4 d，可溶性鈣結合量、可溶性鈣質量分數均逐漸增加；發酵5 d后，可溶性鈣質量分數沒有明顯的增加，而可溶性鈣結合量逐漸減少。原因可能是隨著發酵時間的延長，黑曲霉生長過程中所產生的酶使蛋白肽陸續酶解成氨基酸，使得可溶性鈣質量分數、可溶性鈣結合量不斷增加，但是隨著黑曲霉的生長代謝，營養物質逐漸減少，代謝廢物逐漸增多以及各種水解酶類不斷產生，導致可溶性鈣質量分數基本不變，可溶性鈣結合量逐漸減少。

圖5 發酵時間對可溶性鈣質量分數和可溶性鈣結合量的影響

2.6 正交試驗結果

根據以上的單因素試驗分析，選取發酵溫度37℃，以水分、麩皮添加量、發酵時間為試驗因素設計正交試驗，因素水平見表1，正交試驗結果見表2，主體間效應檢驗見表3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

表3 主體間效應的檢驗

由以上正交試驗結果分析可知，對可溶性鈣結合量的影響依次是水分、麩皮添加量、發酵時間；優化的工藝條件參數為A2B3C2，即水分50%，麩皮添加量25%，發酵時間5 d。以此發酵條件進行3組試驗，測得平均可溶性鈣質量分數為247.5 mg/100 g，平均可溶性鈣結合量為195.6 mg/100 g。

2.7 鈣肽得率

當以3倍體積的無水乙醇沉淀鈣肽時，鈣肽得率為0.481%；當無水乙醇達到4倍時，鈣肽得率為0.594%；當無水乙醇達到5倍時，鈣肽得率為0.679%；但是隨著無水乙醇繼續增加，鈣肽得率趨于平緩，其原因可能是其中鈣肽絡合物含量不變，繼續添加無水乙醇，鈣肽絡合物已經被完全沉淀。出于經濟考慮，選擇5倍體積的無水乙醇沉淀鈣肽。如圖6所示。

圖6 無水乙醇體積對鈣肽得率的影響

2.8 鈣肽絡合物膠囊化

經微膠囊化包埋的鈣肽絡合物，成品呈淡黃色粉，易吸潮，流動性較差。由于外表面包裹著一層卵磷脂，久置于空氣中易氧化，因而應在密封干燥的條件下存放。微膠囊化的鈣肽絡合物便于貯存和使用，優勢明顯。

3 結論

利用蝦皮中含有的鈣與蛋白質資源，加入麩皮，用黑曲霉發酵使其產生鈣肽絡合物，鈣肽絡合物進入小腸后可以阻止鈣在堿性環境下形成不溶物，提高人體鈣的吸收利用率。制備成補鈣膠囊，方便實用。

毛蝦蝦皮黑曲霉發酵產生鈣肽絡合物最佳工藝條件為麩皮添加量25%、溫度37 ℃、水分50%、發酵時間5 d，測得可溶性鈣質量分數為247.5 mg/100 g，可溶性鈣結合量為195.6 mg/100 g，肽鈣得率為0.679%。與用米曲霉發酵蝦皮產生鈣肽絡合物結論基本相同，米曲霉發酵蝦皮可溶性鈣結合量為為168.5±7 mg/100 g，鈣肽得率為0.625%±0.01%[8]。黑曲霉發酵可溶性鈣結合量和鈣肽得率更高。黑曲霉安全，成本低，更適合大規模生產。