表面脫乙酰化魔芋葡甘聚糖的制備及吸附膽固醇能力

羅媛，羅立新，賈克寒

武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院（武漢 430072）

隨著社會的飛速發(fā)展，健康成為人們關(guān)注的重點，高血脂、高血壓、高血糖等慢性病逐步普遍化和低齡化，傳統(tǒng)藥物大量服用又會帶來不良反應(yīng)，這促使人們在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中尋求解決的方法。魔芋是一種具有巨大地下球莖的天南星科多年生草本植物，其球莖中主要成分為魔芋葡甘聚糖（KGM）。KGM的主鏈是由葡萄糖和甘露糖以1∶1.4/1∶1.6由β-1,4-糖苷鍵連接，甘露糖的C-3位置上以β-1,3鍵連接支鏈結(jié)構(gòu)，每32個糖殘基上有3個支鏈，平均每9～19個糖殘基有1個乙酰基團[1-4]，乙?；鶊F賦予其溶解特性[5]。

KGM可以在腸道表面成膜，平衡腸道內(nèi)糖類和油脂的吸收，也可通過裹挾或者吸附，減少腸道內(nèi)對于糖類、脂質(zhì)等物質(zhì)的吸收利用，其被細菌分解產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以促進腸道蠕動。魔芋葡甘聚糖作為一種天然可溶性的膳食纖維，具有潤腸通便[6]、平穩(wěn)血糖[7]、降低膽固醇[8]、減肥降脂[9]等功效。在高血脂人群中的使用效果十分顯著，孕婦和嬰幼兒便秘等方面因其安全性也很受關(guān)注。但魔芋葡甘聚糖在水中會迅速溶解，快速凝膠化，且1%（W/W）KGM溶液黏度可達30000 cps[4]，造成難以服用的問題。KGM研究主要集中于交聯(lián)后魔芋顆粒[10-11]、包埋魔芋顆粒[12]、復(fù)合膜[13]及魔芋葡甘聚糖酯化改性[14]等。利用簡單的醇堿工藝在室溫下脫除KGM顆粒表面的乙?；?，制備一種難溶或者不溶于水的表面脫乙?；в笃细示厶牵⊿Da-KGM）。開展酶解試驗及體外模擬吸附試驗，探究SDa-KGM的生物降解性和對高血脂的代表物膽固醇的吸附作用。表面脫乙?；в笃细示厶墙鉀Q魔芋葡甘聚糖人體食用的難題，并保留有魔芋葡甘聚糖的生物降解性和安全特性，在體重控制、“三高”控制、孕婦和兒童便秘等方面具有相當優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

魔芋精粉（武漢纖濃生物科技有限公司）；纖維素酶（浙江一諾生物科技有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV752紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；SHA-c數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（常州博遠實驗分析儀器廠）；JZ-2數(shù)顯離心機（金壇市洪科儀器廠）；85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）；FA2004B分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；101-3型干燥箱（中國上海市實驗儀器總廠）；傅里葉紅外光譜儀iS10（美國Thermo公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 表面脫乙酰化魔芋葡甘聚糖（SDa-KGM）制備

稱取10.0 g魔芋精粉置于100 mL一定體積濃度的乙醇溶液中，在室溫下（25 ℃）充分溶脹0.5 h，加入適量的氫氧化鈉溶液，持續(xù)攪拌反應(yīng)一段時間后，抽濾，用乙醇反復(fù)洗滌、浸泡顆粒至pH中性，將樣品顆粒置于50 ℃烘箱中干燥至恒重，即得表面脫乙?；в笃细示厶钱a(chǎn)品顆粒，用SDa-KGM（乙醇體積濃度-NaOH量與KGM質(zhì)量比-反應(yīng)時間）來表示。

1.2.1.1 乙醇體積分數(shù)的影響

取10.0 g魔芋精粉分別加入到30%，40%，50%，60%和70%（V/V）乙醇的溶液中，溶脹充分后加入6 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，室溫下反應(yīng)1 h進行脫乙?；幚?。

1.2.1.2 氫氧化鈉溶液添加量的影響

取10.0 g的魔芋精粉加入到40%乙醇的溶液中，溶脹充分后分別加入3.0，4.0，5.0，6.0和7.0 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液，室溫下反應(yīng)1 h進行脫乙?；幚?。

1.2.1.3 反應(yīng)時間的影響

取10.0 g魔芋精粉加入到40%乙醇的溶液中，溶脹充分后加入6 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，室溫下分別反應(yīng)0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h進行脫乙酰化處理。

1.2.2 紅外測試

樣品采用KBr壓片法，在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描。

1.2.3 產(chǎn)品顆粒溶脹體積測定及結(jié)構(gòu)特征

顆粒溶脹體積測定：稱取10.000 g干燥的SDa-KGM固體粉末于100 mL具塞量筒中，加入100 mL去離子水使其溶脹，搖散使其溶脹均勻，靜置30 min記錄1次，直至溶脹體積穩(wěn)定。

孔隙率及骨架密度測定：SDa-KGM用去離子水充分浸濕后，用濾紙吸干顆粒間的水分，測定樣品的濕重（Ww，g）和體積（V，mL）。將樣品分別用乙醇、丙酮和乙醚反復(fù)多次洗滌，在50 ℃烘箱中干燥至恒重，測量樣品的干重（Wd，g）。固體試樣的骨架密度（ρg，g/mL）、平均孔容量（Vp，mL/g）和孔隙率（Pr，%）按式（1）～（3）計算。

1.2.4 SDa-KGM生物降解性

取0.050 g KGM/SDa-KGM于25 mL 4 g/L纖維素酶溶液中，在50 ℃水浴恒溫振蕩器中，分別反應(yīng)20，40，60，80，100和120 min，在沸水浴中10 min終止酶反應(yīng)。離心取1 mL上層清液，加入蒸餾水稀釋，加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑[15]，用752紫外分光光度計在500 nm處比色測定，以魔芋葡甘聚糖的含量表示KGM/SDa-KGM的水解程度。

1.2.5 SDa-KGM吸附膽固醇的等溫吸附性能

稱取一定量的表面脫乙?；疜GM加入到0.015，0.05，0.1，0.5，1.0，3和5 g/L的膽固醇溶液，在37 ℃水浴中振蕩一定時間后，離心，取上層清液，采用GB/T 5009.128—2003《食品中膽固醇的測定》[16]測定膽固醇濃度，計算SDa-KGM的吸附容量以衡量SDa-KGM吸附能力。

1.2.6 SDa-KGM吸附膽固醇的動力學(xué)附性能

稱取一定量的表面脫乙?；疜GM加入到3.0 g/L膽固醇溶液中，在37 ℃水浴中振蕩一定時間后，離心，取上層清液，采用GB/T 5009.128—2003《食品中膽固醇的測定》[16]以測定膽固醇濃度，計算SDa-KGM的吸附容量以衡量SDa-KGM吸附能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成條件對KGM表面脫乙酰化的影響

2.1.1 乙醇體積分數(shù)的影響

由圖1（a）可知，3416.03 cm-1和870.49 cm-1處分別為KGM的締合羥基伸縮振動吸收峰和β-D糖苷鍵特征吸收峰。在SDa-KGM紅外圖中這些特征峰明顯存在，說明SDa-KGM依然保持KGM的一級主鏈結(jié)構(gòu)。KGM紅外圖中1727.54 cm-1處代表乙酰基中—C＝O的伸縮振動吸收峰，說明KGM有乙酰基的存在。起始階段隨著乙醇體積分數(shù)增加，該吸收特征峰消失，乙醇體積分數(shù)30%～50%時，紅外圖譜中乙酰基的特征吸收峰完全消失。乙醇體積分數(shù)60%～70%時，乙?；卣魑辗逯匦鲁霈F(xiàn)。這是由于乙醇可以抑制KGM顆粒的溶脹，乙醇體積分數(shù)越大，KGM顆粒溶脹體積就越小，與堿接觸的表面積也就越小，進而影響KGM與堿的脫乙?；磻?yīng)。

由圖1（b）可知，10 g SDa-KGM干粉體積約10 mL，隨著乙醇體積分數(shù)增加，每10 g SDa-KGM顆粒在水溶液中的溶脹體積也從48 mL逐步增大到76 mL。這是由于脫乙?；潭鹊挠绊?，葡甘露聚糖主鏈上的乙?；x予其溶解特性，脫乙酰化程度越高，顆粒表面分子鏈之間的交聯(lián)就越緊密，SDa-KGM顆粒在水溶液中溶脹體積也就越小。

圖1 不同乙醇體積分數(shù)影響下SDa-KGM的紅外光譜圖（a）和在水溶液中的溶脹體積（b）

2.1.2 氫氧化鈉溶液添加量的影響

由圖2（a）可知，隨著1 mol/L氫氧化鈉溶液體積增加，乙?；闹饾u脫除。加入3～5 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液時，紅外圖中乙?；纳炜s振動吸收峰逐漸消失，加入6 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液時，紅外圖中乙?；奶卣魑辗逋耆АＤв笃细示厶侵械囊阴；且怎ユI的形式連接在糖殘基上，顆粒表面乙?；拿摮龑嵸|(zhì)是酯的水解，所以氫氧化鈉溶液添加量的增加可以提高乙?；拿摮潭取Ｊヒ阴；穆銧钅в笃细示厶怯捎诜肿又g形成氫鍵而產(chǎn)生部分結(jié)晶作用，以這種結(jié)晶為節(jié)點形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[19-20]而不溶于水。隨著氫氧化鈉溶液體積增加，SDa-KGM顆粒在水溶液中的溶脹體積先逐步減小后趨近不變，6 mL之后1 mol/L氫氧化鈉溶液量繼續(xù)加大，SDa-KGM顆粒在水中溶脹體積不再減小。

圖2 不同堿體積影響下SDa-KGM的紅外光譜圖（a）和在水溶液中的溶脹體積（b）

2.1.3 反應(yīng)時間的影響

由圖3（a）可知，隨著脫乙?；瘯r間延長，乙酰基逐步脫除。反應(yīng)時間0.5 h時，紅外圖譜中還存在微弱的乙?；奈辗?。反應(yīng)時間1.0 h時，乙?；卣魑辗逋耆?。由圖3（b）可知，隨著反應(yīng)時間延長，SDa-KGM顆粒在水溶液中的溶脹體積逐步減小后趨近平緩。反應(yīng)時間0.5～1.0 h時，10 g SDa-KGM顆粒在水中溶脹體積從60 mL減小到54 mL，這與乙?；拇嬖谟嘘P(guān)。反應(yīng)時間1.0～2.5 h時，由于乙酰基特征吸收峰消失，SDa-KGM在水溶液中的溶脹體積不會隨著反應(yīng)時間延長而大幅下降。

圖3 不同反應(yīng)時間影響下SDa-KGM的紅外光譜圖（a）和在水溶液中的溶脹體積（b）

2.1.4 SDa-KGM的結(jié)構(gòu)特征

分別在乙醇體積分數(shù)30%，40%，50%，60%，70%和90%制備結(jié)構(gòu)特征不同的SDa-KGM。隨反應(yīng)條件乙醇體積分數(shù)增大，SDa-KGM產(chǎn)品顆粒在水溶液中的溶脹體積增大，孔隙率和孔容量也逐步增大，骨架密度逐步減小。可以通過改變制備工藝條件乙醇體積分數(shù)、加入NaOH的量、反應(yīng)時間，合成不同結(jié)構(gòu)特征的SDa-KGM產(chǎn)品。SDa-KGM（90-2.4%-1）顆粒在水溶脹體積最大到達7.10 mL/g，孔隙率為57.13%，孔容量達到6.777 mL/g，骨架密度為0.190 g/mL。如表1所示。

表1 不同乙醇體積濃度下產(chǎn)品結(jié)構(gòu)特征

2.2 SDa-KGM生物降解性

如圖4所示，其他制備條件一定，SDa-KGM（30-2.4%-1）在不同乙醇體積分數(shù)中交聯(lián)最為緊密，水溶脹體積最小。纖維素酶水解SDa-KGM（30-2.4%-1）顆粒，開始酶解時，魔芋葡甘聚糖的百分含量隨時間增長而增加，酶解時間40 min時，SDa-KGM（30-2.4%-1）酶解溶液中有極少漂浮未酶解的SDa-KGM顆粒，酶解時間60 min時，SDa-KGM（30-2.4%-1）酶解溶液基本到達澄清，幾乎完全完成酶解。酶解時間60～80 min時，酶解的魔芋葡甘露聚糖含量基本穩(wěn)定，其含量為62.15%。

圖4 纖維素酶水解SDa-KGM和KGM

纖維素水解KGM趨勢和SDa-KGM（30-2.4%-1）基本一致，KGM酶解時間為40 min時基本完成酶解，時間略早于SDa-KGM（30-2.4%-1）酶解。其到達最大酶解程度時，魔芋葡甘聚糖含量為61.75%。試驗表明，纖維素水解SDa-KGM（30-2.4%-1）和KGM，魔芋葡甘聚糖含量均在62%左右，酶解程度基本一致，說明SDa-KGM（30-2.4%-1）還是保持KGM的生物降解性。SDa-KGM具有良好的生物降解性。

2.3 膽固醇等溫吸附曲線

如圖5所示，隨著膽固醇起始質(zhì)量濃度增加，3種SDa-KGM顆粒對于膽固醇的吸附容量先增大后減少。其中，膽固醇質(zhì)量濃度3 g/L時，3種脫乙?；潭炔煌念w粒均到達最大吸附量，SDa-KGM（30-2.4%-1）的最大吸附量為83.1790 mg/g，SDa-KGM（50-2.4%-1）的最大吸附量為86.0690 mg/g，而SDa-KGM（90-2.4%-1）最大吸附量則到達100.5189 mg/g。3種SDa-KGM對膽固醇的吸附量存在差異，并且膽固醇的起始質(zhì)量濃度對吸附容量的影響較大。膽固醇起始質(zhì)量濃度低時，SDa-KGM對膽固醇的吸附量也較低，并且3種SDa-KGM顆粒對膽固醇的吸附量差別不大。膽固醇質(zhì)量濃度小于1 g/L時，3種顆粒對膽固醇的吸附量基本接近，但膽固醇質(zhì)量濃度達到3 g/L后，SDa-KGM（90-2.4%-1）顆粒對于膽固醇的吸附呈現(xiàn)出優(yōu)勢。

圖5 SDa-KGM膽固醇等溫吸附曲線

利用lnqe對lnCe擬合，圖線性關(guān)系良好，SDa-KGM（90-2.4%-1）吸附膽固醇擬合式為lnqe=1.10468lnCe+3.14346，相關(guān)系數(shù)R=0.9855，符合Freundlich等溫吸附模型，且吸附過程中脫乙酰化魔芋葡甘聚糖對膽固醇的吸附能力較強，屬于不均勻表面吸附。

2.4 膽固醇動力學(xué)吸附曲線

3種表面不同程度脫乙?；哪в笃暇厶穷w粒在3 g/L膽固醇的冰乙酸溶液中振蕩不同時間的吸附容量如圖6所示。3種脫乙酰顆粒吸附膽固醇的速度較快，隨著時間延長，吸附速率隨時間延長而逐漸減小，并且基本在90 min時到達吸附平衡狀態(tài)，SDa-KGM（30-2.4%-1）、SDa-KGM（50-2.4%-1）、SDa-KGM（90-2.4%-1）吸附膽固醇到達平衡時的吸附容量分別為80.2890，83.1790和103.5189 mg/g。SDa-KGM對膽固醇具有良好的吸附能力。隨孔隙率、孔容量的增大，其吸附性能略有增大。朱維維等[12]研究的不溶于水的殼聚糖包埋魔芋組合物在相同條件下達到吸附平衡，對膽固醇吸附容量為114.8 mg/g，與SDa-KGM（90-2.4%-1）對膽固醇吸附容量相接近，但SDa-KGM制備工藝條件及原料更為簡單。

圖6 SDa-KGM膽固醇動力學(xué)吸附曲線

SDa-KGM（90-2.4%-1）數(shù)據(jù)中，利用t/Q對t作圖線性關(guān)系良好，t/q=0.38903+0.00670t，相關(guān)系數(shù)R=0.9400，較吻合Lagergren準二級動力學(xué)模型，說明SDa-KGM吸附膽固醇不僅與溶液濃度有關(guān)，還受到化學(xué)吸附機理的控制，與脫乙?；潭纫灿幸欢P(guān)系。SDa-KGM顆粒溶脹體積大則與膽固醇的接觸面積大，有能力吸附更多的膽固醇。表面脫乙?；в笃细示厶穷w粒表面的乙?；摮蟪蔀榱u基，而羥基是一個親水基團，會減少與膽固醇的結(jié)合。

3 結(jié)論

通過簡單的生產(chǎn)工藝解決KGM服用困難的難題。表面脫乙?；疜GM顆粒由于分子之間形成氫鍵而產(chǎn)生部分結(jié)晶作用，以結(jié)晶為節(jié)點形成顆粒表面的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而成為不溶于水的顆粒。室溫下KGM表面脫乙?；囼灡砻鳎绊慡Da-KGM顆粒的溶脹體積因素為乙醇的體積分數(shù)、氫氧化鈉與KGM的質(zhì)量比、反應(yīng)時間。從紅外分析可知，SDa-KGM依然保持了魔芋葡甘聚糖的一級主鏈結(jié)構(gòu)。纖維素水解試驗表明SDa-KGM還是保持了KGM原有的生物降解性。SDa-KGM在不同反應(yīng)條件下的結(jié)構(gòu)特征及水溶脹體積不同，對于減肥人群可以選擇相對在水中溶脹體積大的SDa-KGM顆粒攝入來達到飽腹感以減少食物攝入的目的。

SDa-KGM模擬體外試驗吸附三高代表物膽固醇，探究SDa-KGM對于消化道吸收的影響。SDa-KGM（90-2.4%-1）孔隙率為57.13%，孔容量達6.777 mL/g，骨架密度為0.190 g/mL，對膽固醇的吸附容量達103.5189 mg/g。SDa-KGM產(chǎn)品在控制“三高”方面很有前景，SDa-KGM通過改變反應(yīng)條件可以改變顆粒的結(jié)構(gòu)特征。隨著孔容量增加，SDa-KGM吸附膽固醇等能力也會有所增強。

表面脫乙酰化魔芋葡甘聚糖在模擬試驗中解決KGM服用困難的不足，表現(xiàn)出生物降解性、安全性及控制血脂等特性，在體重控制、“三高”控制、孕婦和兒童便秘等方面具有優(yōu)勢，為后續(xù)開發(fā)健康安全的降血脂藥物或健康食品提供思路及依據(jù)。