木棗果蔬酵素發酵工藝優化

賀瑩，武宇詩

呂梁學院生命科學系（呂梁 033000）

木棗，屬于大棗的一種，主要集中分布在中國的北方地區，是山西、陜西的主要栽培品種。其中，呂梁大棗頗為出名，年產量大，棗果大而色彩斑斕，厚實柔軟，性溫，富含營養成分和生物活性成分，屬于天然保健產品中的一種保健食品，可食用也可藥用，具有極高的利用價值，深受廣大群眾的喜愛[1]。酵素，也可以叫作是“酶”，酵素是用各種同種或者不同的動植物材料作為原料，應用不同的微生物，在特定的條件下進行發酵工藝，所產生的具有一定生物活性的物質。它的這些活性都是通過選取的原材料，微生物營養物質，還有一些經過發酵的過程中所產生的。植物酵素具有潤腸通便[2]、解酒保肝[3]等功效。我國關于酵素產品的研究尚處于初級階段，市場發展也才剛剛起步。

以木棗為原料，選用酵母菌和植物乳桿菌作為菌種，制備木棗酵素。選取不同的發酵時間、發酵溫度、接種量、菌種比例等因素設計單因素試驗，以超氧化物歧化（SOD）酶活力的大小為指標，進行分析研究，以期提高木棗的加工利用率和酵素產品的多樣性，同時對果蔬酵素產品的研究提供可行的技術指導和理論依據[4-5]。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料及藥品

木棗：太原萬果山電子商務有限公司；安琪牌活性干酵母，購于河南萬邦實業公司；植物乳桿菌，購于河南萬邦實業公司；果膠酶，購于浙江仁和生物科技有限公司；酵母膏粉，購于天津市光復精細化工研究所。

1.1.2 儀器與設備

DFT-100手提式高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；RE-5298旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司）；CPA225D電子天平：溫賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SPX-250生化培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 木棗酵素工藝流程及操作要點

操作要點：

1) 預處理：將木棗清洗干凈去核，置于干燥箱中調整溫度為80 ℃，干燥3 h后用粉碎機粉碎并過篩。按1∶5（g/mL）的比例加入蒸餾水得到木棗汁。

2) 酶解：在處理后的木棗汁中加入果膠酶，果膠酶的用量2 mL/kg，然后放在電熱恒溫水浴鍋中45 ℃酶解2 h。

3) 調配：取出手持糖度儀在室溫條件下，先用蒸餾水調整刻度，在木棗果汁中少量多次地添加蔗糖，將糖度調整為20%。

4) 菌種活化：在錐形瓶中加入適量的活性干酵母，加入一些蒸餾水，放在提前預熱好的水浴鍋中水浴加熱；配制MRS肉湯培養基，加入植物乳桿菌并在37 ℃條件下進行活化48 h。

5) 殺菌：將木棗果汁在70 ℃條件下保持30 min進行巴氏殺菌，最后冷卻至室溫。

6) 接種：將活化好的酵母菌、植物乳桿菌按試驗的比例接入殺菌后的木棗果汁中，備用。

7) 發酵：調整接種的木棗果汁的溫度和時間，靜置發酵，得到木棗酵素，測定SOD酶活力的大小[6]。

1.2.2 SOD酶活力的測定

SOD酶活力的測定[7]：在25 ℃條件下在試管中加入0.2 mL稀釋的樣液，然后依次將2.5 mL濃度為0.1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液（pH為8.2，內含1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉）、2 mL蒸餾水、0.15 mL 4.5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后立即倒入石英比色皿中，在波長325 nm條件下分別測定初始時和1 min后的吸光度值，二者之差則為A1，空白比色皿用10 mmol/L鹽酸調零，同樣地用蒸餾水代替樣液測定吸光度A0，SOD酶活性按式（1）計算。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 發酵時間的選擇

固定糖度20%，加入植物乳桿菌4%，在38 ℃條件下，在不同發酵時間（1，2，3，4和5 d）發酵后，測定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[8]。

1.2.3.2 發酵溫度的選擇

固定糖度20%，加入植物乳桿菌4%，發酵2 d，在不同發酵溫度（34，36，38，40和42 ℃）發酵后，測定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[9]。

1.2.3.3 菌種比例的選擇

固定糖度20%，在38 ℃條件下進行發酵2 d，在不同菌種比例（1∶3，2∶3，1∶1，3∶2和3∶1）發酵后，測定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[10]。

1.2.3.4 接種量的選擇

固定糖度20%，在38 ℃條件下進行發酵2 d，在不同接種量（2%，4%，6%，8%和10%）發酵后，測定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[11]。

1.2.4 響應面試驗設計

根據單因素試驗的結果，將發酵時間（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）三個因素作為響應面試驗的考察對象，以超氧化物歧化酶（SOD）活力為評價指標[12]，設計三因素三水平的Box-Benhnken中心組合試驗，探索木棗果蔬酵素發酵的最佳工藝參數。試驗因素、水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵時間對SOD酶活力的影響

由圖1可知，SOD酶活力隨著發酵時間的變化而變化，剛開始酶活力明顯上升，持續發酵到第2天時酶活力為277.89 U/mL，到達第3天的時候，酶活力明顯下降，第4天比第3天稍有下降，其原因是發酵后期總酸不斷上升，菌體處于衰亡期，消耗大量的營養物質，抑制了SOD酶的積累，導致酶活力呈下降的趨勢，所以選擇發酵時間是2 d較佳。

圖1 發酵時間對超氧化物歧化酶活力的影響

2.1.2 發酵溫度對SOD酶活力的影響

由圖2可知，SOD酶活力隨著溫度的變化而變化，34～38 ℃ SOD酶活力明顯上升，當溫度達到38 ℃時，顯示出SOD酶活力為277.47 U/mL，溫度高于38 ℃或低于38 ℃時，不利于植物乳桿菌的生長，從而影響SOD酶活力的大小，所以選擇發酵溫度為38 ℃較佳。

圖2 發酵溫度對超氧化物歧化酶活力的影響

2.1.3 菌種比例對SOD酶活力的影響

由圖3可知，當菌種比例為1∶3和2∶3時，SOD酶活力隨著酵母菌比例的增大呈逐漸上升趨勢，當菌種比例為2∶3時，SOD酶活力的最大值為275.81 U/mL。當菌種比例為3∶2和3∶1時，SOD酶活力隨著植物乳桿菌比例的下降呈現緩慢下降的趨勢，總體看來酶活力的大小變化比較平穩，所以不選菌種比例為響應面法試驗的因素。

圖3 菌種比例對超氧化物歧化酶活力的影響

2.1.4 接種量對SOD酶活力的影響

由圖4可知，酶活力隨著接種量的增大先逐漸升高，達到SOD酶活力最大值276.85 U/mL。繼續增加接種量時，因為接種量太大，導致SOD酶活力稍有下降趨勢，所以選擇接種量為4%較佳。

圖4 接種量對超氧化物歧化酶活力的影響

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗結果

從單因素試驗結果的分析中，選取發酵時間（A）、發酵溫度（B）、植物乳桿菌接種量（C）為考察因素，根據響應面分析法中心組合設計原理進行響應面試驗，木棗果素酵素發酵工藝優化的響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.2 回歸模型的建立

對響應面試驗結果應用Design Expert 7.0軟件進行多元回歸分析，得到SOD酶活力大小與發酵時間（A）、發酵溫度（B）、植物乳桿菌接種量（C）的二次回歸模型為：

式中，各項系數的絕對值的大小表示各影響因素對超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響大小，系數的正負表示該因素影響的方向，各因素對超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響由大到小依次為A＞C＞B。

根據表3可以看出，模型p=0.0001＜0.01，由此可以得出該模型具有極顯著性，說明選取因素不同，超氧化物歧化酶（SOD）活力有顯著差異；失擬項p=0.4086＞0.05，說明在試驗選取的因素水平范圍內，擬合程度較好，說明這個模型是可靠的，可用來分析和預測試驗結果。從表3可以看出，在試驗選取的這三個因素水平范圍內，A、C影響極顯著（p＜0.01），B影響顯著（p＜0.05），二次項A2、B2對模型影響極顯著，C2對模型影響顯著。

表3 回歸模型方差分析

2.2.3 響應曲面分析

根據響應曲面坡度的彎曲程度來體現SOD酶活力影響程度的大小。如果響應曲面相對平緩，說明其可容忍處理條件的影響[10]。等高線圖的形狀可以表示各變量之間的交互作用是否顯著，橢圓狀表明變量間的交互作用顯著，圓形狀表明交互作用不顯著[11]。圖5～圖7反映出發酵時間、溫度、接種量對超氧化物歧化酶（SOD）活力大小的影響。

圖5 發酵時間和發酵溫度交互作用的響應面與等高線

圖6 發酵時間和接種量交互作用的響應面與等高線

圖7 發酵溫度和接種量交互作用的響應面與等高線

由圖5可知，發酵時間和發酵溫度對SOD酶活力的影響，呈現先上升后下降走勢。從圖6可以看出，在不斷發酵的同時加入越來越多的菌，SOD酶活力先上升后下降呈現弧狀。通過對圖7研究可以看出，在發酵溫度和接種量的不斷增大的情況下，SOD酶活力同樣出現先上升后下降的走向。由此可知，各因素之間交互作用的影響與單因素影響不一致，各因素間交互作用對響應值影響顯著。

2.2.4 最佳提取條件驗證

對制備工藝進行優化時運用Design-Expert 7.0軟件，分析可得出發酵時間2 d、發酵溫度38 ℃、接種量4%是木棗酵素發酵工藝的最佳條件，在這種情況下SOD酶活力大小為278.64 U/mL。并經過3次平行試驗，得到的SOD酶活力為278.41 U/mL。因此，可以得出通過響應面優化得到的回歸方程模型及最佳制備工藝是可靠的。

3 結論

試驗通過采用木棗為原料，發酵菌種選用酵母菌和植物乳桿菌來制備木棗酵素。通過設計單因素試驗，選取不同的發酵時間、發酵溫度、接種量，測定酶活力得到各因素對超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響趨勢圖，在此基礎上通過三因素三水平響應面優化試驗設計，全面且直觀地分析了各因素對SOD酶活力的影響，以及各因素之間的交互作用，建立回歸模型，經過驗證試驗之后說明木棗果蔬酵素的模型非常靠譜，可得出影響SOD酶活力的主要因素是發酵時間和植物乳桿菌的接種量。木棗酵素發酵工藝優化的最佳條件為發酵時間2 d、發酵溫度38 ℃、植物乳桿菌接種量4%。在此優化條件下，經驗證試驗，超氧化物歧化酶（SOD）活力為278.64 U/mL。此次試驗得到的最佳工藝條件為木棗果蔬酵素發酵工藝的生產提供理論研究和科學依據，為酵素產業生產應用提供有效利用和參考價值。