高濃度蔗糖乙醇分批發酵過程

劉明，伍時華，龍秀鋒，易弋，趙雪梅

1.廣西科技大學生物與化學工程學院（柳州 545006）；2.廣西科技大學廣西糖資源綠色加工重點實驗室（柳州 545006）

廣西盛產甘蔗，甘蔗主要用來生產白砂糖，副產物甘蔗糖蜜主要用于發酵生產酒精，可加工成食用酒精、醫用酒精和燃料乙醇[1]等產品。醫用酒精是新冠肺炎疫情防控的重要物資，用量劇增。蔗糖酒精發酵用的釀酒酵母能分泌蔗糖水解酶，在細胞外水解蔗糖生成果糖和葡萄糖[2]，酵母細胞在胞內利用葡萄糖和果糖經糖酵解途徑生成丙酮酸，在無氧條件下丙酮酸經氧化脫羧和加氫還原轉化為乙醇。葡萄糖與果糖共用一套膜運輸和酶催化體系，但由于膜運輸和酶親和力的差異，酵母葡萄糖利用率大于果糖利用率[3-4]。

甘蔗汁和甘蔗糖蜜乙醇發酵的文獻有很多，模擬甘蔗汁發酵下果糖和葡萄糖利用的差異性研究[5-7]，不同濃度甘蔗原汁發酵和調整甘蔗汁總糖濃度進行高濃度乙醇發酵研究[8-11]，不同菌株對甘蔗糖蜜乙醇發酵比較和可行性研究[12-14]，甘蔗糖蜜在不同工藝下高產酒精[15-17]等方面，但是鮮有從過程中探究蔗糖乙醇發酵過程規律的文獻，因此研究高濃度蔗糖乙醇發酵過程中酵母、乙醇、糖類過程中的變化就顯得比較有意義。試驗研究高質量濃度（260 g/L）蔗糖乙醇分批發酵過程中酵母生長、乙醇生成、總糖消耗的規律，為實現甘蔗糖蜜和甘蔗汁高濃度乙醇發酵生產提供試驗研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母GJ2008（Saccharomycescerevisiae，廣西科技大學發酵工程研究所保藏，適用于蔗糖高濃度乙醇發酵）。

1.1.2 培養基

一（二）級種子培養基：葡萄糖20（40）g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH自然。

蔗糖發酵培養基：蔗糖260 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH自然。

以上培養基均使用高壓蒸汽115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑與原料

葡萄糖、果糖（AR級，天津市科密歐化學試劑有限公司）；蔗糖、硫酸（西隴科學股份有限公司）；乙腈、乙醇（安徽時聯特種溶劑有限公司）；酵母粉、蛋白胨（BR級，廣東環凱微生物科技公司）；蔗糖（市售）。

1.1.4 儀器與設備

HITACHI高效液相色譜分析儀、HIMAC大容量冷凍離心機（日本株式會社日立制作所）；BIOTECH-5BG×5-9400五聯5 L發酵罐（上海保興生物設備公司）；LDZH-100KBS立式壓力滅菌器（上海申安醫療器械廠）；BX43生物顯微鏡（奧林巴斯有限公司）；ZWYR-C2402觸控二疊加搖床（上海智誠分析儀器制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養方法

將實驗室保存的釀酒酵母GJ2008菌種斜面接一環至一級種子培養基（50 mL三角瓶裝液量30 mL）中，按150 r/min搖床32 ℃培養12 h，取菌液離心去上清，用無菌水稀釋成10倍濃縮菌懸液。將一級種子濃縮菌懸液接至二級種子培養基（500 mL三角瓶裝液量300 mL）中，按150 r/min搖床32 ℃培養8 h后離心去上清，用無菌水稀釋菌泥成10倍濃縮菌懸液。

1.2.2 發酵方法

將二級種子濃縮菌懸液接至5 L發酵罐（3 L裝液量）發酵培養基，轉速150 r/min，發酵溫度32 ℃，微通氧80 mL/min。

1.3 檢測分析方法

酵母細胞數的測定采用血球計數板法。

液相色譜檢測糖條件：流動相為V乙腈∶V超純水=75∶25（色譜純），流速1 mL/min，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，示差折光檢測器溫度35 ℃。

液相色譜檢測乙醇條件：流動相采用5 mmol/L硫酸溶液，流速0.6 mL/min，進樣量20 μL，柱溫35 ℃；示差折光檢測器溫度40 ℃。所有上機樣品均經超純水稀釋至合適倍數經0.45 μm濾膜過濾至進樣瓶中。

1.4 計算公式

式中：葡萄糖或果糖減少量=前次取樣葡萄糖或果糖實測值+取樣間隔時間內蔗糖水解增加的葡萄糖或果糖的量-當時取樣葡萄糖或果糖實測值

2 結果與分析

2.1 高濃度蔗糖乙醇分批發酵過程曲線

從0 h開始每隔3 h從5 L發酵罐中取發酵液樣品測定蔗糖、果糖、葡萄糖、乙醇濃度以及酵母細胞數，繪制260 g/L蔗糖乙醇分批發酵過程曲線見圖1。

圖1 260 g/L蔗糖乙醇分批發酵過程曲線

蔗糖乙醇發酵過程，蔗糖快速水解產生葡萄糖和果糖，酵母細胞利用葡萄糖和果糖進行生長繁殖和無氧代謝生成乙醇，總糖消耗的實質是葡萄糖和果糖消耗。圖1中殘葡萄糖和殘果糖先升高后降低，是由葡萄糖和果糖的蔗糖水解生成量與同期消耗量的多少決定。葡萄糖和果糖生成量大于消耗量則表現為殘糖量升高，反之降低。發酵0～15 h酵母快速生長，同期蔗糖快速水解；發酵6～30 h總糖大量消耗，同期乙醇大量生成；發酵至30 h，殘葡萄糖量已很低，但殘果糖量相對較高。要更深入探究蔗糖水解、葡萄糖和果糖消耗、酵母生長、乙醇生成的規律及總糖消耗、酵母生長和乙醇生成的相互關系，需要進一步分析和討論。

2.2 高濃度蔗糖乙醇分批發酵酵母生長規律

依據圖1作圖數據計算發酵過程不同時間段的酵母生長速率，結合酵母生長曲線，得到圖2。

結合圖2的生長速率，260 g/L蔗糖乙醇分批發酵過程的酵母生長曲線可分為快速生長期（0～15 h）和穩定期（15～39 h，27 h后酵母細胞數略有下降）。從0 h的細胞濃度（1.4×107個/mL）和0～3 h的酵母生長速率（1.23×107CFU/（mL·h））可知，0～3 h細胞生長較快，這主要與所接種的二級種子處于快速生長后期，酵母細胞繁殖能力強有關。細胞在6～9 h達到最大生長速率5.27×107CFU/（mL·h），發酵過程細胞濃度最大值為4.23×108CFU/mL，明顯比常規酒精厭氧發酵細胞數（1.2×108～1.5×108CFU/mL）高，這主要與試驗采用微通氧（通風量80 mL/min）發酵技術有關。高濃度乙醇發酵過程連續或間歇微通氧，可使酵母細胞產生更多的能量，細胞結構物質得以合成和更新，大幅提高酵母濃度，細胞活力得以維持，增強酵母生產乙醇的能力，明顯縮短發酵時間。

圖2 260 g/L蔗糖乙醇分批發酵過程酵母生長曲線及其生長速率圖

2.3 高濃度蔗糖乙醇分批發酵乙醇生成規律

依據圖1作圖數據計算發酵過程不同時間段的乙醇生成速率，結合乙醇生成曲線，得到圖3。

由圖3可知，260 g/L蔗糖乙醇分批發酵過程中6～30 h是乙醇生成主要階段（對發酵終了生成的乙醇量占比92.69%），6～15 h乙醇加速生成（占比59.16%），15～30 h乙醇降速生成（占比37.28%），12～15 h乙醇生成速率最大達到6.7 g/（L·h）。此外，0～3 h和36～39 h的乙醇生成量很少（占比0.25%和0.1%），3～6 h和30～36 h共9 h的乙醇生成量較少（占比6.96%）。結合2.2的酵母生長規律分析，得知高濃度蔗糖乙醇分批發酵過程乙醇生成與酵母生長偶聯，而且相當一部分的總糖需要在酵母生長穩定期轉化為乙醇。

圖3 260 g/L蔗糖乙醇分批發酵過程乙醇生成曲線及其速率圖

2.4 高濃度蔗糖乙醇分批發酵蔗糖水解、果糖和葡萄糖消耗規律

依據圖1殘蔗糖、殘果糖和殘葡萄糖數據，計算并繪制發酵過程蔗糖水解、果糖和葡萄糖消耗曲線和不同時間段的蔗糖水解、果糖和葡萄糖消耗速率得到圖4和圖5。將發酵過程分為四個區間進行蔗糖水解、葡萄糖和果糖消耗對比，結果如表1。

表1 糖類物質區間變化表

圖4 蔗糖水解、果糖和葡萄糖消耗曲線圖

圖5 蔗糖水解、果糖和葡萄糖消耗速率圖

綜合表1和圖4、圖5進行分析可知，蔗糖水解主要集中在發酵0～15 h（占比92.29%），說明酵母在快速生長期大量釋放蔗糖水解酶。期間0～3 h蔗糖水解較多（占比22.58%），水解速率（18.65 g/（L·h））較高，這是由于接種的二級種子細胞不僅繁殖能力強，而且成熟的酵母細胞能夠迅速釋放蔗糖水解酶到胞外水解蔗糖生成葡萄糖和果糖。葡萄糖消耗主要集中在3～27 h（占比91.43%），同期果糖消耗占比為77.37%，果糖消耗同比低14.06%，并且葡萄糖平均消耗速率（4.61 g/（L·h））大于果糖平均消耗速率（3.53 g/（L·h））。發酵終了殘葡萄糖只有1.46 g/L，而殘果糖13.49 g/L。結果表明，高濃度蔗糖乙醇發酵過程，酵母細胞對葡萄糖的消耗大于對果糖的消耗。有關果糖利用不徹底的原因分析，與發酵條件中葡萄糖濃度[19]、乙醇[3]、溫度[4]等的影響有關。更與酵母細胞己糖跨膜轉運對葡萄糖和果糖的親和力不同相關，這是造成發酵過程中葡萄糖消耗速率高于果糖消耗速率的重要原因[20]。發酵后期如何提高果糖消耗，降低殘果糖量，值得進一步深入研究。

2.5 高濃度蔗糖乙醇分批發酵過程酵母生長、總糖消耗、乙醇生成的關系分析

依據圖4果糖和葡萄糖消耗數據和圖1中酵母生長、乙醇生成數據計算并繪制圖6和圖7。

糖醇轉化率是生成的乙醇對所消耗的總糖（葡萄糖+果糖）的百分比，理論值為51.1%，實際糖醇轉化率越高，說明消耗的總糖轉化為乙醇越多。酵母細胞消耗的總糖用于菌體生長、維持菌體生命活動、代謝產生乙醇、CO2及高級醇等產物，因此，發酵全過程的實際糖醇轉化率（48%）要低于理論值，但不同發酵時間段的糖醇轉化率會有所不同。試驗檢測的是酵母細胞外發酵液中的殘葡萄糖、殘果糖濃度和乙醇濃度，細胞外的葡萄糖和果糖進入細胞經無氧代謝轉化成乙醇和乙醇排出到細胞外需要一定時間。分析圖6和圖7，結合前面的酵母生長、乙醇生成和蔗糖水解、葡萄糖與果糖消耗規律分析可知，260 g/L蔗糖乙醇分批發酵0 h-6 h糖醇轉化率尚低（21.8%），耗糖主要用于細胞快速生長，合成并釋放蔗糖水解酶到細胞外快速水解蔗糖；發酵6～30 h是乙醇生成的主要階段，糖醇轉化率高（46.72%），12～15 h的糖醇轉化率最高（63.36%），15～21 h的糖醇轉化率超過50%；發酵30～39 h的糖醇轉化率從37.0%較快降低到14.59%，這9 h的糖醇轉化率偏低（30.53%）。全發酵過程酵母消耗總糖252.36 g/L，產生乙醇111.17 g/L，糖醇轉化率為44%。發酵后期糖醇轉化率偏低，是導致全發酵過程糖醇轉化率偏低的重要原因。

圖6 260 g/L蔗糖乙醇分批發酵過程酵母生長、乙醇生成、總糖消耗折線圖

圖7 260 g/L蔗糖乙醇分批發酵過程酵母生長、乙醇生成、總糖消耗速率圖

2.6 高濃度蔗糖乙醇分批發酵發酵效果分析

將圖1數據按照1.4中公式處理并計算得到表2。

總糖發酵效率反映糖醇轉化實際值對理論值的百分比，是評價乙醇發酵效果的重要指標，與發酵終了的乙醇濃度和殘總糖濃度密切相關。總糖濃度一定時，發酵得到的乙醇濃度越高、殘總糖越低，總糖發酵效率就越高，發酵效果就更好。由表2可知，蔗糖水解率（98.89%）和葡萄糖利用率（98.91%）很高，葡萄糖利用率比果糖利用率（89.92%）高出8.99%；總糖發酵效率（80.5%）偏低（未達到90%），這主要與耗糖發酵效率（86.19%）偏低（未達到92%～95%）、總糖利用率（93.39%）偏低（未達到98%）和乙醇質量濃度（111.1 g/L）偏低（未達到125 g/L）有關。殘總糖（17.86 g/L）偏高（大于5 g/L），主要是殘果糖（13.49 g/L）偏高（占殘總糖的75.5%），其次是殘蔗糖（2.89 g/L，相當總糖3.03g/L，占比17%），會導致總糖利用率偏低。我們正在研究高濃度蔗糖乙醇分批發酵過程釀酒酵母細胞活性（細胞數及存活率）和發酵活力（耗糖能力和乙醇生成能力）及其提高策略，努力提高發酵終了乙醇濃度和糖醇轉化率。

表2 260 g/L蔗糖乙醇分批發酵結果

3 結論

開展260 g/L蔗糖乙醇5 L罐分批發酵試驗，結果表明，酵母生長分為快速生長期（0～15 h）和穩定期（15～39 h）；蔗糖快速水解主要集中在0～15 h，從15 h緩慢水解到27 h停止水解；葡萄糖消耗主要集中在3～27 h，整個發酵過程葡萄糖利用率（98.91%）比果糖利用率（89.92%）高8.99%，發酵終了殘葡萄糖（1.46 g/L）少而殘果糖（13.49 g/L）較多；發酵6～30 h是乙醇生成（占比92.69%）主要階段，糖醇轉化率高（46.72%），而發酵后期（30～39 h）糖醇轉化率（30.53%）偏低，是導致全發酵過程糖醇轉化率（44%）偏低的重要原因。因此，高濃度蔗糖乙醇分批發酵要提高發酵效率，一要設法提高果糖利用率，降低殘果糖濃度，二要設法提高發酵后期糖醇轉化率。