QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法測定海參中敵敵畏

張玲，丁洪流，紀麗君，葉湖 ，山珊，吳翠玲

1.蘇州市食品檢驗檢測中心（蘇州 215104）；2.蘇州市產品質量監督檢驗院（蘇州 215104）；3.安捷倫科技（中國）有限公司（北京 100102）

海參齊名于魚翅、燕窩和人參，被公認為世界八大珍品之一，含有生物活性物質，如皂苷、不飽脂肪酸和蛋白質[1-2]，是一種低脂肪、高蛋白食物。其營養價值高，具有延緩性腺衰老、提高記憶力、抗腫瘤及防止動脈硬化等作用。隨著海參營養價值知識的普及，海參也作為一道菜品逐漸進入百姓的餐桌。正是由于海參在市場上十分走俏，即產生了行業亂象，已有調查表明海參產品良莠不齊，消費者對其難辨優劣，商家為了獲取暴利，加膠基加糖現象已成了行業公開的秘密。另外，養殖環境對海參的品質有較大決定作用，央視“3·15晚會”曝光了海參養殖中使用敵敵畏現象的普遍性，海參養殖戶在池塘中加入敵敵畏，其目的是清理池塘中的螃蟹、魚蝦等生物，而海參對敵敵畏的抗藥性較強，不會被藥死。按照我國農藥管理條例規定，農藥使用者不得擴大農藥的使用范圍，而敵敵畏的使用范圍顯然不包括海參養殖。敵敵畏具有高效、快速、廣譜性等特點，是目前應用最為廣泛的有機磷殺蟲劑[3]，可用于農作物殺蟲，但應有安全間隔期，一般規定在農作物收獲前7 d停止用藥。GB 2763—2019[4]對敵敵畏這種有機磷農藥殘留檢測方法的具體規定為谷物按照GB 23200.113[5]、GB/T 5009.20[6]、SN/T 2324[7]方法檢測；油料和油脂按照GB 23200.113[5]、GB/T 5009.20[6]方法檢測；蔬菜、水果按照GB 23200.8[8]、GB 23200.113[5]、GB/T 5009.20[6]、NY/T 761[9]方法檢測；調味料按照GB 23200.113[5]方法檢測。另外，對敵敵畏的檢測方法研究還有氣質聯用法[10-11]、液質聯用法[12]等。以上這些方法更多見諸于對蔬菜、水果、谷物、油料和油脂等的檢測。由于海參具有豐富的蛋白質，比果蔬等農藥殘留分析更為復雜，在現行農殘分析標準中未見針對海參中敵敵畏的檢測方法。

QuEChERS是一種在農產品方面檢測的快速樣品前處理技術[13]，具有操作簡單、環保經濟和適用范圍廣等特點。此次試驗旨在建立一種基于QuEChERS前處理的高效液相色譜-串聯質譜（High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）測定海參中敵敵畏方法，為執法提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參樣品（市售）；敵敵畏（質量濃度為100 μg/mL，北京壇墨質檢科技有限公司）；QuEChERS萃取試劑盒（EN 15662，安捷倫科技有限公司）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（200 mg，3 mL，安捷倫科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；甲酸、甲酸銨（質譜級，蘇州精密化學科技有限公司）；試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

AgilentQQQ-6470、高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Mili-Q型超純水儀（美國密理博公司）；ME204E電子天平（梅特勒-托利多集團）；Multi Reax自動渦旋儀（德國Heidolph公司）；MD200-1氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 敵敵畏標準溶液的配制

標準儲備液：精密稱取敵敵畏標準品，用甲醇溶液配制成質量濃度為10 μg/mL的溶液，作為標準儲備液。

空白樣品提取液：用不含敵敵畏殘留的樣品，按照1.3.2制備空白樣品提取液。

標準工作溶液：精密吸取適量工作溶液，用甲醇溶液稀釋成質量濃度為5，10，20，50和100 ng/mL標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g（精確到0.001 g）鮮海參樣品，置于50 mL離心管中，加入3 mL水，加陶瓷均質子渦旋1 min；加入10 mL乙腈，振蕩3 min，加入Bond Elut QuEChERS EN萃取鹽包，劇烈振蕩1 min，以8000 r/min低溫離心10 min，取2.4 mL乙腈提取液，置于15 mL離心管中，加0.6 mL水渦旋，過Captiva EMR-Lipid柱，重力自流，接收流出液，抽干小柱，合并接收液于15 mL離心管中，收集流出液在30 ℃條件下氮吹至小于1 mL，用乙腈定容至1 mL，過0.22 μm濾膜上機分析。

1.3.3 測定條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流動相A：0.1%（V/V）甲酸-2 mmol/L乙酸銨；流動相B：0.1 %（V/V）甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0 min 80% A，4.0 min 10% A，6.0 min 10% A，6.5 min 80% A，9 min 80% A；流速：400 μL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

1.3.3.2 質譜條件

離子化方式：正離子源噴霧（Positive electrospray ionization，ESI+），多反應監測（Multi reaction monitor，MRM）采集模式；干燥器溫度250 ℃，干燥器流速7 L/min，霧化器電壓30 psi，鞘氣溫度325 ℃，鞘氣流速11 L/min，碰撞能量3500 V，噴嘴電壓500 V。

1.4 數據處理

定性分析：在相同的色譜條件和質譜條件下，對照敵敵畏物質標準品定性離子以及出峰時間，對樣品中敵敵畏物質進行定性分析。

定量分析：通過不同敵敵畏物質定量離子的峰面積，根據敵敵畏物質標準曲線的回歸方程，計算樣品中敵敵畏成分的含量。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

取敵敵畏標準品，采用多反應監測掃描模式進行子離子優化。質譜條件見1.3.3.2。母離子為M+1，液相部分只連接兩通進行優化，優化后的質譜參數見表1，以響應信號最高的作為定量離子，響應信號次之的作為定性離子。

表1 敵敵畏多反應監測掃描模式的質譜參數

2.2 流動相的選擇及洗脫梯度的優化

采用水及乙腈作為流動相，敵敵畏色譜峰呈現矮胖的形狀，而采用乙酸銨及乙腈為流動相，目標物峰形尖銳，由于是采用正離子電離模式，在流動相中加入0.1%甲酸會更加有利于目標物離子化[14]，因此確定以0.1%（V/V）甲酸-2 mmol/L乙酸銨溶液（A）和0.1%（V/V）甲酸-乙腈（B）作為流動相。流動相洗脫梯度優化的最終結果見表2。結果顯示，4 min內敵敵畏目標物出峰（圖1），出峰時間為3.989 min。

表2 梯度洗脫程序

圖1 敵敵畏物質的定量離子色譜圖

2.3 固相萃取柱的選擇

試驗對樣品的凈化采用Captiva EMR-Lipid固相萃取柱。試驗采用乙腈對海參中大量的蛋白物質進行提取和沉淀，對比了Bond Elut PPL和Captiva EMR-Lipid兩類固相萃取柱的凈化和保留效果，以加標回收率作為評價指標。結果顯示，Captiva EMR-Lipid固相萃取柱的吸附及凈化能力較好，能夠有效地將海參樣品中的色素及脂肪吸附，不僅有效地去除了對目標化合物的干擾物，還確保了待測組分較少的損失，能夠在保證良好凈化效果的同時使操作過程更簡單。

2.4 檢測方法的線性關系和檢出限

標準曲線在5～100 ng/mL的質量濃度范圍內線性關系良好，敵敵畏線性相關系數值為0.998，標準曲線見圖2。以信噪比大于3為檢出限，檢出限為5 μg/kg。

表3 敵敵畏的線性試驗結果

圖2 敵敵畏標準曲線

2.5 方法回收率及精密度

選用鮮海參陰性樣品，對其添加不同濃度敵敵畏標準物質，加標回收試驗的3個水平加標量分別為10，20和40 μg/kg，每個水平重復6次測定，結果見表4。結果顯示，加標回收率在80%～89%之間，相對標準偏差為2.78%～3.56%（n=6），方法精密度及準確度均較高。海參樣品加標質譜圖譜見圖3。

表4 敵敵畏的加標回收率結果（n=6）

圖3 敵敵畏成分加標質譜圖譜

2.6 樣品應用

為了進一步驗證試驗方法的實用性，將其他市售干制海參及新鮮海參按照所優化的條件進行檢測，結果均未檢出。今后將進一步加大抽樣量并擴大抽樣樣品品類，對新建方法進行充分驗證。

3 結論與討論

試驗采用QuEChERS前處理的方法，提高了海參中敵敵畏物質農藥殘留定量的準確度和重現性。試驗利用液質聯用儀進行檢測，該方法簡單易行、可操作、準確靈敏、基質干凈以及減少儀器污染，既提高工作效率，又節約勞動成本，可為海參中敵敵畏物質農藥殘留的檢測提供科學客觀、準確可靠的方法。