白術-蒼術藥對干預潰瘍性結腸炎作用機制的網絡藥理學研究

戴明明 廖 丹 程偉玲 王春鵬 林才志

1.廣西中醫藥大學研究生院，廣西南寧 530000；2.廣西中醫藥大學基礎醫學院，廣西南寧 530000；3.廣西中醫藥大學第一附屬醫院脾胃肝病科，廣西南寧 530000

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種主要以結腸或直腸黏膜連續性、彌漫性的炎癥改變為特征的慢性非特異性腸道炎癥性疾病[1]，主要的臨床癥狀為腹瀉、大便伴有黏液或膿血、腹痛等。病情往往反復遷延，治療后容易復發，難以完全治愈，并存在一定的癌變風險[2]。UC 發病機制尚未完全明確，目前研究認為主要與遺傳易感性、自身免疫、外在環境的刺激及腸道黏膜屏障損傷有較大關聯[3]。因此，治療方法以控制炎癥、改善臨床癥狀、減少復發為主[4]，藥物選擇上主要選擇使用水楊酸類、糖皮質激素類、免疫抑制劑類藥物[5-6]，但仍缺乏能夠徹底治愈UC 的方法，且長時間藥物治療帶來的不良反應一直困擾著醫患雙方[7]。

中醫藥治療UC 是不可忽視的一種手段，UC 屬中醫“痢疾”“泄瀉”等范疇。白術、蒼術為中醫治療瀉痢之要藥，二者常作為藥對配伍使用。現代藥理學研究表明，二者的主要成分具有保護腸黏膜、抑制炎癥、增強免疫力等藥理作用，其水提物能糾正UC 大鼠模型的免疫紊亂，機制可能與其調節炎癥因子白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-17 的作用有關[8-10]。但目前UC 的臨床研究仍然多針對于近期療效，機制研究相對較少[11]。本研究基于網絡藥理學探討白術-蒼術干預UC 的作用機制，為后續進一步研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 白術-蒼術藥對主要化學成分研究

使用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）與中藥分子機制的生物信息學分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，Batman-TCM）收集白術-蒼術的主要化學成分，并使用PubChem 數據庫來核對這些化合物的名稱與分子結構。設置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%[12]及類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選的條件來篩選這些化合物。

1.2 蒼術-白術藥對的靶點預測和UC 靶點及蒼術-白術藥對治病靶點研究

通過Batman-TCM 分析平臺，檢索白術-蒼術的主要化學成分可能作用靶點，靶點獲取設置條件Prediction Score cutoff＞20，利用Uniprot 數據庫校正靶點名稱。以“ulcerative colitis”為關鍵詞在人類基因數據庫GeneCards 檢索并下載有關的基因。使用“Venny”將蒼術-白術藥對靶點與UC 作用靶點取交集。

1.3 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡構建

使用Cytoscape 3.2.1 將上述的預測和篩選結果，構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡。

1.4 白術-蒼術藥對治病靶點蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein ineraction，PPI）網絡數據

通過String 數據庫分別構建白術-蒼術藥對治病靶點PPI 網絡圖，并繪制PPI 網絡中蛋白的條形圖。

1.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

運用R 語言軟件對“1.3”中的靶點蛋白進行GO功能富集分析與KEGG 通路富集分析。從富集分析來闡釋白術-蒼術藥對生物學角度的科學內涵。

2 結果

2.1 白術-蒼術藥對主要成分及靶點

利用TCMSP 和Batman-TCM 收集白術-蒼術的主要化學成分，經篩選后共獲取16 個有效活性成分，其中白術7 個、蒼術9 個。見表1。

表1 篩選出的白術-蒼術主要成分與靶點

2.2 UC 相關基因

通過GeneCards 數據庫共檢索出4209 個UC 相關基因，與白術和蒼術有效成分對應的靶基因取交集，得到259 個共同基因。見圖1。

圖1 藥物成分靶點與疾病靶點韋恩圖

2.3 構建藥物-活性成分-靶點-疾病網絡

運用Cytoscape 軟件來構建網絡，見圖2，可見白術-蒼術藥對通過259 種共同有效成分作用于與UC相關的31 個靶點。圖中八邊形表示白術-蒼術共同有效成分，圓形表示藥物-UC 共同靶點。

圖2 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖

2.4 構建PPI 網絡

把“2.3”中得到的共同靶點導入String 數據庫里面，得到PPI 網絡互作圖，見圖3，圖中共含有31 個節點與1920 條邊。圖中的各個節點表示各基因蛋白，節點互相間的連接線代表所相接的2 個蛋白存在相互作用的關系，連接線越粗則代表這種關系越強。依據鄰接節點數，選出居于前30 位靶點，見圖4，左列是基因名，數字代表著相應基因鄰接節點數目，例如，“MAPK1”鄰接節點的數目為41。每個基因鄰接的節點數目越多，則意味著其成為核心基因的概率就越大。分析出核心基因主要有E1A 結合蛋白P300（EP300）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activation protein kinase 1，MAPK1）等。

圖3 白術-蒼術藥對治病靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

圖4 篩選出的前30 位核心基因

2.5 關鍵靶基因GO 功能與KEGG 通路富集分析

利用R 語言軟件進行GO 功能和KEGG 通路富集分析后，獲得GO 條目1038 個，其中生物過程有829 個，細胞組分有59 個，分子功能有150 個。分別選取前20 位，富集情況見圖5～7，主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、調控DNA 模板轉錄、細胞增殖與凋亡的調節、細胞外信號調節激酶、細胞內質網膜、炎癥反應、特異序列DNA 綁定、蛋白激酶結合、轉錄共激活因子活性等。KEGG 通路富集中（P ＜0.05）有122 條，選取前18 條通路，富集情況見圖8?？梢娭饕蠵I3K/Akt 信號通路、缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路、人類嗜T 細胞病毒1 型（human T-cell lymphotropic virus-1，HTLV-1）、TNF 信號通路、MAPK 信號通路等。

圖5 GO（生物過程）富集氣泡圖

圖6 GO（細胞組分）富集氣泡圖

圖7 GO（分子功能）富集氣泡圖

圖8 KEGG 富集氣泡圖

3 討論

UC 屬于慢性非特異性炎癥性腸病，相關炎癥信號通路在特定條件刺激下被激活，從而引起腸黏膜炎癥損傷。本文通過網絡藥理學分析得出EP300、TNF-α等核心基因在腸黏膜的炎癥反應過程中有重要作用，NF-κB、MAPK、PI3K/Akt 等通路屬于炎癥信號通路，與UC 的發病有密切聯系，具體闡述如下：

NF-κB 在UC 發病機制中的作用：研究表明，NF-κB 在調控與黏膜炎癥反應相關的基因中起核心作用，在炎癥信號刺激下，NF-κB 從細胞膜向細胞核轉位，介導相關下游靶基因的釋放，調控細胞壞死、凋亡與癌變等。正常情況下，介導NF-κB 通路的激活信號在T 細胞及其他大多數細胞類型中都是短暫的，主要刺激典型NF-κB 通路，但NF-κB 在HTLV-1 轉化的T 細胞株和新近分離的T 細胞中均可被激活，導致HTLV-1 可對NF-κB 進行持續性激活[13]，使得結腸黏膜持續性損傷，而阻斷叉形頭轉錄因子O 亞型3的表達，可使NF-κB 活性受到抑制，從而讓結腸黏膜損傷得到緩解[14-15]。

NF-κB 與MAPK、PI3K/Akt 信號通路在UC 發病機制中的關系：巨噬細胞特異性表達激活了許多炎癥反應鏈，包括Toll 樣受體4（Toll-like receptor，TLR4）、PI3K/Akt 及其下游NF-κB 和MAPK 信號通路等。這些通路在調節UC 患者細胞因子釋放和參與UC 腸道炎癥和免疫反應中起著核心作用[16]。PI3K/Akt 信號通路在腸道通過大量的細胞因子介導異常炎癥反應，其信號活化后，首要的功能就是激活NF-κB 并參與TNF-α、IL-1 等促炎性細胞因子釋放，誘導UC 發病[17-18]，而阻斷PI3K/Akt 信號通路可以緩解結腸黏膜的損傷[19-20]。在炎癥反應過程中，巨噬細胞中MAPK 的磷酸化對NF-κB 的激活和隨后促炎癥介質的釋放至關重要[21]。阻斷TLR4 及其下游的NF-κB/MAPK 通路，可降低TLR4、NF-κB、MAPK 信號相關蛋白的表達，同時下調體內炎癥因子的釋放，從而減輕UC 的炎癥反應[22]。

核心基因EP300、TNF-α 與UC 發病的關聯：P300 蛋白是一種多向共激活因子，參與結腸組織細胞的凋亡、分化和增殖，體細胞突變EP300 基因已在多種人類惡性腫瘤中發現，包括結腸癌[23]，而EP300 表達水平與結腸癌淋巴結浸潤之間存在一定相關性，組織中腫瘤蛋白TP53 的表達水平也高于正常結腸組織[24]。通過巨噬細胞產生的炎癥啟動因子TNF-α 可促使UC 的發生與進展[25]，其主要通過對中性粒細胞趨化作用，浸潤腸黏膜組織細胞，使其出現炎癥損傷[26-27]。研究表明，藥物可通過抑制TNF-α 的表達水平，并上調相關抗炎因子的表達，修復結腸組織，促進潰瘍的愈合，且與IL-22 聯合干預UC 的治療，具有一定靶向治療的意義[28]。

目前為止，UC 的發病原因與機制研究仍是一個瓶頸，一般認為其主要與環境、感染、遺傳及免疫因素相關性較大[29]。本研究采用網絡藥理學的方法，對于白術-蒼術藥對通過多成分、多靶點、多通路來干預UC 的作用機制進行了闡釋，為下一步實驗性的藥理研究提供了一定線索，拓展了思路。然而目前對UC 的認知仍處在不斷完善之中，其次，網絡藥理學也具有一定自身局限性，因此可能存在一定程度的偏倚風險，仍需要后續的實驗性研究進一步佐證。