原漿啤酒發酵過程中蛋白質和總糖含量的變化

米 智，劉荔貞，武曉紅，李旭東

（1.山西大同大學生命科學學院，山西大同 037009；2.山西大同大學化學與化工學院，山西大同 037009）

啤酒是以大麥芽或添加輔料，啤酒花和水為主要原料，經過酵母菌發酵釀制而成的，含有大量CO2、酒精。原漿啤酒是不加水，不經過濾，不經滅活工序，保留鮮活酵母的生啤酒原液。啤酒具有良好的口感，素有液體面包美稱而頗受消費大眾的喜愛[1]。

啤酒風味主要有：聞到的香氣（aroma）、嘗到的口味（taste）和感覺到的口感（mouthfeel）[2]。消費者選擇啤酒的主要依據是酒味、口感和性價比，口感成了消費者關注的重要質量參數之一[3]。化學成分決定了啤酒的質量品質和風味特色[3]。高級醇類和酯類物質對啤酒特有的風味和香氣有著至關重要的作用[4]，如乙酸乙酯、異戊酯乙酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯負責為“水果味”味道[5]。它們之間巧妙的平衡協調關系，便形成了啤酒獨特的風格。啤酒的苦澀味主要來源于酒花中的樹脂，還有部分來自酵母釀造過程的苦味肽、氨基酸、多酚等非酒花成分的共同作用[6-7]。也有文獻報道稱，啤酒的風味和香氣與二氧化碳壓力具有相關性[8-9]。啤酒中所有風味活性成分都是由酵母菌生命代謝活動產生的，這些化合物決定啤酒的最終質量[10]。

適量飲用啤酒，可降低冠心病等心臟病的發病率，降低糖尿病的死亡率等[11-12]。啤酒還具有抗菌作用和預防骨質疏松和動脈硬化，調節腸道生態平衡，增強機體免疫力，控制血清中的膽固醇等功能[13]。

本研究跟蹤山西大同大學生物工程試驗中心啤酒釀造和發酵整個過程，利用生物化學檢測從麥芽醪進罐第1 d 到成品原漿啤酒出酒期間蛋白質和總糖含量變化情況，期望找到二者含量隨時間變化的規律；成品酒出酒后，與市場常見品牌啤酒進行比較，以期為該試驗中心釀酒工藝改良提供參考及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉，重慶地茂化工試劑有限公司；結晶酚，西安天茂化工有限公司；亞硫酸鈉，濟寧宏明化學試劑有限公司；碘、碘化鉀、葡萄糖，天津光復科技發展有限公司；酚酞，無錫市亞泰聯合化工有限公司；磷酸，北京世紀拓鑫精細化工有限公司；95%乙醇、氫氧化鈉、考馬斯亮藍、牛血清白蛋白，上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。原漿成品啤酒由山西大同大學生物工程試驗中心提供，市售常見品牌啤酒：易拉罐裝雪花、哈爾濱和純生啤酒，均為每聽330 mL。

1.2 儀器與設備

山西大同大學生物工程試驗中心100 L 小試原漿啤酒生產線、糖度儀，山東濟南豪魯機械設備有限公司；BS600H 精密電子天平，太原世成衡器有限公司；HH-6 數顯恒溫水浴鍋，常州市金壇友聯儀器研究所；722N可見分光光度計，大尼科（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 自釀原漿啤酒生產工藝

參考米智等[1]原漿酒生產過程及工藝流程。

1.3.2 總糖含量的測定

（1）葡萄糖標準曲線制作

相關報道稱，3,5-二硝基水楊酸分光光度法用于測定食品中總糖含量基本可行且準確性較高[14-15]。本文測定總糖采用武平[16]和張龍翔[17]的方法，以葡萄糖制作標準曲線，求得線性回歸方程。

取干燥潔凈的試管8支，編號0～7，按順序分別加1 mg/mL 標準葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，加蒸餾水補充至2 mL，再分別加DNS 試劑1.5 mL，沸水浴5 min，冷卻至室溫，加21 mL蒸餾水混合均勻后，以0 號管為對照，在540 nm 下測定各管吸光度，并繪制標準曲線。

（2）啤酒總糖的測定

原漿啤酒發酵過程大約需要14 d 時間，故該實驗總糖檢測從麥芽醪進發酵罐第1 d 開始，到成品酒出酒為止，每天同一時間同一發酵罐取樣，盡可能做到實驗間隔24 h，做平行實驗3 次。總糖測定方法同葡萄糖標準曲線繪制，數據處理公式：

總糖濃度=m×V-1×n×0.9/1000

式中：m為反應液中總糖的質量（mg）；V為反應液的體積（mL）；n為稀釋倍數；0.9為糖苷鍵在斷裂時需要加一分子水；1 000 是mg 與g 之間的轉化倍數；總糖含量的最后單位為g/mL。

1.3.3 蛋白質含量的測定

參照Bradford 改良方法[18]，以牛血清白蛋白制作標準曲線。啤酒樣本預處理方法見文獻[19]。

2 結果與分析

2.1 總糖含量

2.1.1 原漿啤酒發酵過程中總糖含量

根據葡萄糖標準曲線所得方程為：y＝0.1848x-0.0123（x為葡萄糖濃度，y為該葡萄糖濃度下的吸光值），R2=0.9916，計算麥芽醪中總糖濃度（mg/mL）。

圖1是麥芽醪進入發酵罐連續發酵14 d總糖含量的變化趨勢，第1 d的總糖量最高，約為94.2 mg/mL。第2～4 d總糖含量成下降趨勢，而且明顯糖含量低于第1 d，約在42.8～54.2 mg/mL 之間。在之后的10 d 內，總糖含量約在6.7 mg/mL 上下波動，大致呈先升高后降低，再升高最后降低的變化態勢。總體上，總糖在麥芽醪發酵過程中顯著降低，在出酒時的總糖含量約為2.7 mg/mL。

圖1 麥芽醪連續發酵14d總糖含量變化

2.1.2 原漿成品啤酒與市售啤酒總糖含量比較

比較自釀原漿成品啤酒與3種常見市售啤酒的總糖含量，發現原漿成品啤酒總糖含量最高約為11.9 mg/mL，燕京啤酒含量最低約為8.4 mg/mL，而哈爾濱啤酒和純生啤酒居于二者中間，分別為9.4 mg/mL和10.5 mg/mL。

啤酒麥芽醪當中，以糖類物質為主，約占90%，其中可發酵性單糖占總糖類物質的10%左右，二糖中蔗糖約占5%，麥芽糖約占45%～50%，麥芽三糖、棉子糖等三糖物質約占10%～15%，DP4-8 的寡糖約占20%～25%，還有少量的戊糖和戊聚糖等五碳糖、β-葡萄糖、異麥芽糖，約占3%～5%[20]。能被酵母菌發酵的糖類稱為“可發酵糖”。麥芽四糖以上的寡糖、戊糖、異麥芽糖等均不能發酵，故它們會一直存在于啤酒當中，成為啤酒浸出物的主體[21]。此外，麥芽汁當中各種糖的濃度也會影響酵母菌的發酵，存在著“葡萄糖阻遏效應[22-23]”、“巴士德效應[21]”和“克拉勃脫效應[21]”等，影響糖的分解代謝，故自釀原漿啤酒的總糖含量高于其他市售啤酒。

2.2 蛋白質含量

2.2.1 自釀啤酒發酵過程中蛋白質含量

根據蛋白質標準曲線所得方程為：y=0.8376x+0.0417（x為蛋白質濃度，y為該濃度下的吸光值），R2=0.9901，計算麥芽醪中蛋白質濃度（mg/mL）。

圖2 是麥芽醪進入發酵罐連續發酵14 d 蛋白質含量的變化趨勢。從第1 d到第3 d，蛋白質含量呈下降趨勢。第4 d 到第7 d，蛋白含量又呈現上升趨勢，蛋白質含量略高于前3 d。在隨后的1 周時間內，蛋白質含量變化出現2 個極大值，分別是第9 d（約為2.0 mg/mL，同時也是發酵期間的最大值）和第13 d。縱觀整個發酵期間，蛋白質含量的最低值為發酵第3 d，約為1.1 mg/mL。

圖2 麥芽醪連續發酵14 d蛋白質含量變化

2.2.2 原漿成品啤酒與市售啤酒蛋白質含量比較

通過測定不同品種啤酒及自釀原漿成品啤酒蛋白質含量，發現自釀啤酒蛋白質含量最高約為1.4 mg/mL，燕京啤酒含量最低約為0.6 mg/mL，而哈爾濱啤酒和純生啤酒居于二者中間，分別為0.8 mg/mL和0.7 mg/mL。啤酒蛋白質在很大程度上影響起泡性能[24]。蛋白質被分解后產物中有氨基酸和多肽，而多肽物質或蛋白質的存在是形成懸浮物或（和）沉淀物的前驅物質。因此蛋白質含量的多少將直接影響到啤酒非生物穩定性，進而影響啤酒的質量[25]。

3 結論與討論

從整個發酵過程來看，總糖含量呈下降趨勢，尤其前4d最為明顯。后10d總糖含量呈現波動態勢，可能與麥芽醪中糖的種類有關。

自釀原漿啤酒的總糖含量明顯高于其他3種，原因可能有：①自釀原漿啤酒沒有經過過濾，成品酒會含有多種酵母菌不能發酵的糖類；②在釀酒過程中沒有添加任何酶制劑去水解相關的糖類，僅僅靠發芽的大麥自身水解酶系去完成各種糖類的分解，可能不是很徹底。

啤酒發酵初期，接種后的釀酒酵母只能通過吸收麥芽醪中的含氮物質，自身繁殖擴增，因此發酵初期麥芽汁中的蛋白質含量會降低，隨后呈現波動趨勢。酵母菌的生命活動代謝均是以麥芽醪中的各種營養物質為基礎，涉及糖、蛋白質和脂類三大代謝通路，還有很多種風味化學物質，也是一些氨基酸或含氮化合物通過酵母菌轉化而來。因此，糖和蛋白質含量在整個發酵過程含量變化與酵母菌的種類、代謝活動、發酵條件等緊密相關。