多囊卵巢綜合征患者血清microRNA-27a、microRNA-320的表達及其臨床意義*

劉萍，李瑋，謝寶國，于春玲

（1.海南西部中心醫院 婦產科，海南 儋州571799；2.海南醫學院第一附屬醫院生殖醫學科，海南 海口570102）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是以生殖功能障礙、內分泌和糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、高雄激素血癥為特征的臨床綜合征[1]。PCOS 病情可進展為心腦血管疾病、2型糖尿病、子宮內膜癌等遠期并發癥[2]。目前研究認為PCOS 是遺傳和環境等多種因素共同作用的結果，但是具體病因仍不明確。microRNA 具有基因轉錄后表達調控作用，參與生長發育、內分泌紊亂、代謝異常等多種病理生理過程，有研究發現多種microRNA 在PCOS 中異常表達，與PCOS 發病機制密切相關[3]。研究顯示microRNA-27a（miR-27a）可通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）表達參與胰島素抵抗過程[4-5]；microRNA-320（miR-320）則通過調控磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，與胰島素抵抗有關[6-7]。推測miR-27a、miR-320 與PCOS 易感和臨床特征有關，但是目前報道比較少見，尚未明確結論。本文研究血清miR-27a、miR-320 在PCOS 患者中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月—2020年8月海南西部中心醫院收治的180 例PCOS 患者，符合2003年荷蘭鹿特丹PCOS 會議制定標準[8]。排除標準：①合并其他內分泌紊亂性疾病；②近期服用過激素類藥物患者；③卵巢癌、卵巢良性腫瘤、卵巢炎癥等疾病；④高雄激素相關腫瘤或者腎上腺皮質增生。根據胰島素抵抗指數（HOMA-IR） 分為IR 組113 例（HOMA-IR≥ 2.58）和NIR 組67 例（HOMA-IR<2.58）[9]。另選取同期于本院婦科門診體檢的80 例健康女性作為對照組。對照組納入標準：①排卵及內分泌功能正常；②近3 個月內未服用雌激素類藥物；③經B 超檢查子宮卵巢形態正常排除PCOS，并經系統檢查排除糖尿病、高血壓、心血管疾病及肝腎功能異常者。IR 組年齡19～39 歲，平均（28.68±4.32）歲，病程2～11年，平均（6.45±1.32）年。NIR 組年齡21～39 歲，平均（28.71±4.36）歲，病程3～10年，平均（6.12±1.03）年。對照組年齡23～41 歲，平均（28.72±4.68）歲。IR 組、NIR 組、對照組年齡比較，差異無統計學意義（P>0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者簽署同意書。

1.2 血清miR-27a、miR-320及臨床生化指標檢測

所有受試者均于月經第3～5 天采集靜脈血3 ml注入干燥試管，血液凝固后取上層液4℃3 000 r/min離心15 min。采用Trizol 法提取總RNA，選擇吸光度值A260/A280 比值位于1.9～2.1 的RNA 樣品，采用M-MLV 逆轉錄酶（Epicentre 公司）將其逆轉錄為cDNA。CFX96 實時熒光PCR 儀（美國Bio-Rad）檢測血清miR-27a、miR-320 的表達。引物序列檢測及合成由上海基康公司完成。引物序列：miR-27a正向 5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3'，反向5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；miR-320 正向，5'-AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA-3'，反向 5'-GCCCUCUCAACCCAGCUUUUUU-3'；β-actin 正向5'-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3'，反向 5'-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3'。反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTMII（2×）12.5 μl，dNTP 1.6 μl，Taq DNA 聚合酶1 μ l，正反向引物10 μ mol/L 各1 μ l，加反應緩沖液至20 μl。反應條件：92℃預變性20 s，96℃變性2 s，85℃延伸20 s，80℃退火6 s，共30個循環。以β-actin為內參，2-ΔΔCt計算miR-27a、miR-320 mRNA 相對表達量，取3 次試驗平均值。

采用美國雅培i2000 化學發光分析儀及其配套試劑測定血清促黃體生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）、睪酮（T）。使用日立HITACHI 7600-020 全自動生化分析儀及其配套試劑，采用酶法檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、直接法檢測低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。美國強生穩豪血糖儀檢測末梢血空腹血糖（FPG），餐后2 h 血糖（2 hBG）。美國貝克曼庫爾特ACCESS 2 全自動免疫分析儀及其配套試劑檢測空腹胰島素（FINS）。根據FPG、FINS 計算穩態模型胰島素抵抗指數（HOMA-IR）。HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.3 超聲檢查

GE Voluson E 8 彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率7.5 MHz，于月經第3～5 天行經陰道超聲檢查，閉經者口服安宮黃體酮治療撤藥性出血后檢查。獲取卵巢最大切面后測量卵巢體積，計數卵泡數，所有數據均測量3 次取其平均值。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差表示（±s）或中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，比較用單因素方差分析（進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗）或H檢驗（進一步兩兩比較采用χ2檢驗）。相關性分析用Pearson 法或Spearman法。影響因素的分析用多因素Logistic 回歸模型，繪制ROC 曲線。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床和實驗室指標比較

IR 組、NIR 組及對照組的BMI、卵泡數、卵巢體積、T、LH、TC、LDL-C、FPG、2 hBG、FINS、HOMA-IR 比較，差異有統計學意義（P<0.05）。IR組、NIR 組卵泡數多于對照組（P<0.05），卵巢體積大于對照組（P<0.05），BMI、T、LH、TC、LDLC、FPG、2 hBG、FINS、HOMA-IR 水平高于對照組（P<0.05）；IR 組BMI、T、TC、HOMA-IR 水平高于NIR 組（P<0.05）。見表1。

表1 IR組、NIR組和對照組臨床和實驗室指標的比較

2.2 血清miR-27a、miR-320 mRNA 相對表達量比較

IR 組、NIR 組及對照組的血清miR-27a、miR-320 mRNA 的相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）。IR 組血清miR-27a mRNA 相對表達量高于NIR 組和對照組，miR-320 mRNA 相對表達量低于NIR 組和對照組；NIR 組血清miR-27a mRNA 相對表達量高于對照組，miR-320 mRNA 相對表達量低于對照組。見表2。

表2 3組血清miR-27a、miR-320 mRNA相對表達量比較（±s）

表2 3組血清miR-27a、miR-320 mRNA相對表達量比較（±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與NIR組比較，P<0.05。

組別IR組NIR組對照組F 值P 值miR-320 mRNA 1.13±0.27①②2.01±0.45①3.02±0.69 364.541 0.000 n 113 67 80 miR-27a mRNA 4.62±1.03①②2.61±0.49①1.02±0.35 552.273 0.000

2.3 血清miR-27a、miR-320 表達與PCOS 患者臨床病理特征的相關性

血清miR-27a 表達與BMI、卵泡數、卵巢體積、T、TC、HOMA-IR 呈正相關（r=0.749、0.835、0.764、0.867、0.907 和0.882，均P<0.05），miR-320 與卵泡數、卵巢體積、T、HOMA-IR 呈負相關（r=-0.791、-0.808、-0.768 和-0.752，均P<0.05）。與其他指標無相關性（P>0.05）。見表3。

表3 血清miR-27a、miR-320表達與PCOS患者臨床病理特征的相關性

2.4 PCOS易感的危險因素分析

將卵泡數、卵巢體積、BMI、T、LH、TC、LDL-C、FPG、2 hBG、FINS、HOMA-IR、miR-27a、miR-320（連續性變量原值代入）納入Logistic 回歸方程，向后逐步法篩查變量。結果顯示：卵泡數增加[=1.865（95% CI：1.252，2.776）]、T 水平升高[=1.536（95%CI：1.179，2.001）]、HOMA-IR 增加[=1.702（95%CI：1.185，2.446）]、miR-27a 高表達[=1.933（95%CI：1.278，2.923）]、miR-320 低表達[=0.610（95% CI：0.467，0.796）]是PCOS 易感因素（P<0.05）。校正卵泡數、T、HOMA-IR 后miR-27a[=1.625（95% CI：1.420，1.925）]、miR-320[=0.425（95% CI：0.257，0.691]仍與PCOS易感有關（P<0.05）。見表4。

表4 PCOS影響因素的多因素Logistic回歸分析相關參數

2.5 miR-27a、miR-320對PCOS的診斷價值

miR-27a、miR-320 診斷PCOS 的最佳截斷值為2.02、2.29。AUC 分別為0.708（95% CI：0.637，0.779）、0.676（95% CI：0.602，0.750），敏感性分別為72.8%（95% CI：0.670，0.779）、71.1%（95% CI：0.650，0.767），特異性分別為70.0%（95% CI：0.610，0.777）、68.8%（95% CI：0.597，0.766）。聯合兩項指標診斷PCOS 的AUC 為0.917（95% CI：0.869，0.964），高于單獨指標診斷（Z=2.356 和2.612，P=0.013 和0.003），聯合診斷敏感性為93.9%（95% CI：0.902，0.963），特異性為91.3%（95% CI：0.845，0.954）。見圖1。

圖1 miR-27a、miR-320單獨和聯合診斷PCOS的ROC曲線

3 討論

PCOS 是生殖系統內分泌、代謝異常綜合征，以月經紊亂、不孕、高雄激素血癥、影像學提示卵巢增大和（或）多囊卵巢為主要癥狀。遺傳、糖尿病家族史、低出生體重是PCOS發病危險因素。PCOS多伴有高胰島素血癥、血脂異常、超重或肥胖，是糖尿病和心血管疾病發展的危險因素[10]。胰島素抵抗是PCOS發病的始動因素，也是高胰島素血癥和高雄激素血癥的病理生理改變基礎，胰島素抵抗介導的并糖脂代謝紊亂[11]。miRNA 是一組長度為22～25 個核苷酸的非編碼RNA 分子，通過轉錄后調控胰島素抵抗以及葡萄糖代謝相關蛋白表達，參與肥胖、糖尿病及PCOS等發病過程[12]。

miR-27a 是miRNA 家族中功能最顯著的成員之一，位于19p13.13號染色體，具有調控細胞增殖分化、血管生成、促炎等多種生物學功能，現有研究顯示miR-27a 降低Toll 樣受體4 的表達，抑制缺血再灌注損傷中的炎癥反應，抑制腎小管上皮細胞[13]，miR-27a表達與大腸癌患者遠處轉移和腫瘤分級有關[14]。本研究發現miR-27a 在PCOS 中高表達，miR-27a 表達與卵巢體積、卵泡數、T 呈正相關，miR-27a 高表達是PCOS發病的危險因素，說明miR-27a與PCOS易感以及卵巢體積增加、卵泡數增多以及高雄激素血癥有關。現有研究顯示miR-27a在卵巢顆粒細胞中有豐富表達，參與卵巢濾泡發育的過程，miR-27a通過靶向Smad5激活FasL-Fas途徑誘導人顆粒細胞的凋亡，導致卵巢功能早衰[15]。進一步分析發現miR-27a 與PCOS 患者的BMI、TC、HOMA-IR 呈正相關，說明miR-27a 可能與PCOS 肥胖、糖脂代謝紊亂以及胰島素抵抗有關。miR-27 在脂肪組織中表達，是PPARγ的直接靶標和負調節因子，PPARγ 具有調節全身脂質代謝和胰島素敏感性作用，循環血中miR-27a通過調控PPAR-γ 的表達調節脂肪細胞分化[16]。miR-27a過表達可下調PPAR-γ 表達抑制脂肪細胞分化，導致脂肪組織堆積和肥胖，并影響脂質代謝[6]，同時miR-27a 還可通過靶向葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）/絲裂原激活的蛋白激酶14（MAPK 14）/PI3K 調節亞基β 信號通路參與葡萄糖代謝調節，miR-27a 表達可抑制葡萄糖消耗和攝取，誘導葡萄糖代謝異常和胰島素抵抗[17]。miR-27a 可作為PCOS 診斷的潛在生物標志物[18]。

miR-320具有調控細胞增殖分化、抗炎、抗氧化等作用，現有研究顯示miR-320a 在上皮性卵巢癌組織低表達，miR-320 低表達可促使上皮-間質轉化，導致腫瘤細胞增殖及細胞侵襲力增強，促使癌癥惡性進展[19]。miR-320還可通過激活脂肪酸代謝基因的轉錄，介導心臟脂質毒性，誘導糖尿病患者心臟功能障礙[20]。但是其在PCOS 的作用較少報道。本研究發現miR-320 在PCOS 中低表達，miR-320 低表達與PCOS易感、卵巢超聲形態異常、高雄激素血癥均有關。CIRILLO 等[21]報道同樣顯示PCOS 患者顆粒細胞中miR-320 表達下調，miR-320 表達與胰島素水平呈負相關。YIN等[22]研究結果顯示miR-320 通過直接靶向E2F轉錄因子-1（E2F-1）和類固醇形成因子-1（SF-1）調節卵巢顆粒細胞增殖和雌激素生成。E2F-1是一種激活S期所需基因的轉錄因子，E2F-1活性增強可促使細胞周期向S期轉換，誘導細胞凋亡[23]，SF-1在類固醇生成組織的發育和分化中起著重要作用，SF-1受抑制可增強雌激素信號傳導[24]。miR-320可能通過抑制E2F-1，SF-1 表達抑制顆粒細胞凋亡，誘導雌激素合成，miR-320表達缺失則導致卵巢顆粒細胞凋亡，雌激素合成障礙，雄激素水平升高。進一步分析發現miR-320 與PCOS 患者胰島素抵抗水平有關，分析原因為：磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）p85 亞基是miR-320潛在靶標，miR-320通過PI3K信號傳導途徑增強p85表達增加和Akt磷酸化，上調GLUT-4表達，促使葡萄糖攝取，抑制胰島素抵抗[25]。

miR-27a、miR-320 診斷PCOS 均有一定價值，為進一步提高診斷效能，本研究將兩項指標聯合用于診斷PCOS，結果顯示診斷效能明顯提高，分析原因為聯合檢測可避免單獨檢測漏誤診弊端，診斷效能顯著提高。

綜上所述，PCOS 患者血清miR-27a 表達上調，miR-320 表達下調，miR-27a 高表達、miR-320 低表達與PCOS 易感和胰島素抵抗均有關，miR-27a 可能還參與PCOS 患者肥胖以及脂質代謝紊亂機制。miR-27a、miR-320可作為PCOS診斷的參考指標，兩者聯合可提高診斷效能。本研究局限之處在于僅檢測月經第3～5天的miR-27a、miR-320水平，miR-27a、miR-320是否受月經周期影響尚不清楚，希望在以后的研究中進一步拓展。