全反式視黃酸衍生物逆轉高水平胰島素對胃癌細胞BGC-823遷移的作用研究

王 陳，胡安拉，趙奇紅，汪 淵，張素梅

隨著衛生水平提高和預防措施的完善，中國胃癌的發病率和死亡率呈現下降趨勢。但是，胃癌患者的代謝綜合征或其相關疾病風險有所增高。代謝綜合征相關疾病均由胰島素抵抗導致，胰島素抵抗會導致機體代償性分泌更多的胰島素。研究顯示，高水平胰島素人群胃癌的發生風險增加，高胰島素相關飲食和生活方式與消化道腫瘤的風險也密切相關。胰島素能促進一些腫瘤細胞遷移和侵襲。但胰島素與胃癌遷移和侵襲之間的關系尚不清楚。

全反式視黃酸(all-trans retinoic acid,ATRA)能在胰島素環境下抑制腫瘤的進展，但其副作用限制了它的臨床應用。4-氨基-2-三氟甲基-苯基-維甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)是安徽醫科大學合成的一種ATRA衍生物，研究顯示ATPR的抗腫瘤效果明顯優于ATRA。該研究擬探討在高水平胰島素條件下，ATPR對胃癌細胞遷移能力的影響及其潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

ATPR由安徽醫科大學藥學院合成，陳飛虎教授饋贈；ML-7[肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)抑制劑]購自美國Cayman公司；胰島素和結晶紫購自碧云天公司；抗MLCK鼠一抗購自美國Santa公司；抗Claudin 18兔一抗購自英國Abcam公司；抗GAPDH兔一抗、山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗購自美國CST公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清、100×anti-anti和Trypsin-EDTA購自美國Gibco公司；CCK-8試劑購自Biomiky公司；4%多聚甲醛購自武漢塞維爾公司；RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；ECL化學發光顯影液購自天能公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養

人低分化胃癌細胞株BGC-823購自上海中科院細胞庫；細胞培養在含有10%胎牛血清、1×anti-anti的RPMI1640完全培養基中；細胞培養在37 ℃、含有5% CO的潮濕培養箱中；細胞密度達到90%以上時消化換液處理；所有細胞實驗在細胞處于對數生長期時進行；細胞開始實驗之前，用無血清培養基培養6 h進行同步化處理,所有細胞實驗均在低血清培養基(含有0.1% 胎牛血清)培養條件下進行。

1.3 CCK-8細胞增殖實驗

取對數生長期的細胞常規消化，用培養基調整至20 000個/ml的密度，然后取100 μl稀釋后的細胞種到96孔板中；待細胞貼壁后，更換無血清培養基饑餓6 h；然后更換不同濃度胰島素(0.0、0.5、5.0、10.0 ng/ml)培養，分別在24、48 h用CCK-8試劑檢測450 nm波長下的吸光度。檢測方法：棄去96孔板中培養基，然后每個孔加90 μl不含血清培養基和10 μl CCK-8試劑，放到細胞培養箱中繼續培養2 h，然后在酶標儀上檢測450 nm波長下的吸光度。濃度為0.0 ng/ml胰島素作為對照組；BGC-823細胞相對活性=OD(胰島素組)/OD(對照組)。

1.4 形態學觀察

使用倒置相差顯微鏡觀察胰島素作用下BGC-823細胞形態改變；將處于對數生長期的BGC-823細胞常規消化后以5 000個/孔的密度種到6孔板中；細胞饑餓處理后，用0.5和5.0 ng/ml的胰島素處理細胞48 h；濃度為0.0 ng/ml的胰島素作為對照組；分別在24、48 h用顯微鏡觀察細胞形態改變并拍照。

1.5 細胞劃痕實驗

細胞劃痕實驗用來檢測細胞遷移能力改變；取對數生長期的BGC-823細胞消化后以1×10個/ml的密度種到6孔板中；待細胞達到90%密度時用無血清培養基饑餓6 h；用滅菌后200 μl的槍頭劃一條痕并用預熱的PBS將離壁的細胞輕輕沖洗去除；用5.0 ng/ml的胰島素處理細胞48 h，分別在24、48 h用倒置相差顯微鏡觀察細胞劃痕面積愈合程度；0.0 ng/ml胰島素用作對照組。細胞遷移率=(起始面積-胰島素處理后面積)/起始面積×100%。

1.6 Transwell實驗

Transwell細胞遷移實驗用來檢測細胞遷移能力的改變；在24孔培養板中加500 μl含有10%胎牛血清培養基，將Transwell小室放到24孔板中；用含有0.1%胎牛血清培養基將BGC-823細胞消化稀釋后以10 000個/孔的密度種到小室上層；將細胞放到培養箱中分別培養24、48 h后將小室取出，用PBS輕輕漂洗后用4%多聚甲醛固定0.5 h，然后用0.1%結晶紫染色0.5 h；晾干后在倒置相差顯微鏡下隨機選取6個視野拍照并計數發生遷移細胞的數量；細胞相對遷移率=(胰島素刺激組細胞數量-對照組細胞數量)/對照組細胞數量×100%。

1.7 Western blot實驗

收集處理后的細胞，用RIPA細胞裂解液提取總蛋白；用BCA蛋白定量法對各組蛋白濃度進行測量，用2×SDS上樣緩沖液將各組蛋白濃度定為5 μg/μl，100 ℃變性10 min；用10% SDS-PAGE分離膠對蛋白進行分離，然后轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后用純水將膜洗干凈；分別在4 ℃冰箱中過夜孵育一抗(MLCK，1 ∶1 000；Claudin 18，1 ∶1 000；GAPDH，1 ∶1 000)，用TBST(TBS+1%吐溫20)洗膜；用HPR標記的IgG二抗4 ℃孵育4 h；TBST洗膜；用ECL化學發光顯影液顯影；Tanon GIS 軟件分析蛋白表達。

2 結果

2.1 胰島素處理對細胞增殖能力的影響

采用不同濃度胰島素(0.0、0.5、5.0、10.0 ng/ml)刺激BGC-823細胞；使用CCK-8法檢測胰島素在不同時間點(24、48 h)對細胞增殖能力的影響。結果見圖1。與對照組比較，24 h各濃度胰島素處理的細胞相對增殖率分別為(1.03±0.03)、(1.04±0.03)、(1.13±0.04)；48 h各濃度胰島素處理的細胞相對增殖率分別為(1.00±0.03)、(1.03±0.05)、(1.07±0.01)。與對照組比較，0.5、5.0 ng/ml胰島素在48 h內對BGC-823細胞的增殖能力無影響，而10.0 ng/ml胰島素能明顯促進BGC-823細胞增殖能力(

F

=40

.

96,

P

<0.05)。為了避免細胞增殖對細胞遷移的影響，在后續實驗中采用0.5、5.0 ng/ml胰島素進行刺激。

圖1 不同濃度胰島素對細胞增殖能力影響與對照組比較：*P<0.05

2.2 胰島素對BGC-823細胞形態的影響

采用含終濃度0.5、5.0 ng/ml胰島素的培養液，分別處理BGC-823細胞24、48 h，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞變化(見圖2)。處理24 h后，可見對照組的細胞散在、稀疏，細胞近似圓形或多邊形，細胞有所皺縮；在細胞形態上可見呈多邊形的細胞更多，5.0 ng/ml胰島素組部分細胞出現偽足。處理48 h后，對照組細胞形態較一致，大多呈圓形或橢圓形；胰島素作用組細胞之間間隙較大，細胞較分散，細胞形態較對照組變化很明顯，各細胞均有明顯的偽足或出現呈圓形，幾近漂浮的細胞，其中5.0 ng/ml胰島素組細胞幾乎都出現偽足。

圖2 胰島素對細胞形態的影響

2.3 胰島素對BGC-823細胞遷移的影響

為研究胰島素對BGC-823細胞遷移的影響，本研究使用0.5、5.0 ng/ml胰島素處理BGC-823細胞；細胞劃痕實驗和Transwell實驗分別在24、48 h檢測細胞遷移能力的改變。細胞劃痕實驗結果見圖3。對照組、0.5、5.0 ng/ml胰島素處理組細胞24 h遷移率分別為(21.0±1.6)%、(19.0±1.3)%、(29.2±2.0)%；48 h細胞遷移率分別為(22.7±2.4)%、(29.7±2.4)%、(41.3±5.0)%。與對照組比較，0.5 ng/ml胰島素處理48 h后才促進BGC-823細胞遷移能力(

F

=12.50,

P

<0.05)，而5.0 ng/ml胰島素處理24 h后即促進細胞的遷移(

F

=23.06,

P

<0.05)，48 h后促遷移更明顯(

F

=25.31,

P

<0.01)。

圖3 細胞劃痕實驗A：細胞劃痕實驗檢測不同濃度胰島素對細胞遷移能力影響 ×200；B:細胞劃痕實驗結果統計圖；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

Transwell結果見圖4。0.5、5.0 ng/ml胰島素處理的BGC-823細胞24 h相對遷移率分別為(1.10±0.02)、(1.49±0.12)；48 h相對遷移率分別為(1.53±0.09)、(2.05±0.13)。與對照組比較，0.5 ng/ml胰島素處理48 h后才能促進BGC-823細胞的遷移(

F

=78.03,

P

<0.01)，而5.0 ng/ml胰島素處理24 h后即促進細胞的遷移(

F

=37.52,

P

<0.01)，48 h后促遷移更明顯(

F

=146.78,

P

<0.001)。因此5.0 ng/ml作為后續實驗的胰島素刺激濃度。

圖4 Transwell 遷移實驗A:Transwell遷移實驗檢測不同濃度胰島素對細胞遷移能力影響 ×200；B:Transwell實驗結果統計圖；與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.4 ATPR抑制胰島素對BGC-823細胞遷移的促進作用

使用5.0 ng/ml 胰島素、5 μmol/L ATPR和 10 μmol/L ML-7處理BGC-823細胞，通過細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移能力改變。細胞劃痕結果見圖5。24 h對照組、胰島素組、胰島素+ATPR組、胰島素+ML-7組細胞遷移率分別為(27.09±1.48)%、(34.25±1.35)%、(21.61±1.98)%、(16.86±2.70)%，48 h各組細胞遷移率分別為(33.48±1.68)%、(42.52±1.12)%、(18.84±1.65)%、(18.47±2.65)%；與胰島素組比較，ATPR以及ML-7能抑制胰島素對BGC-823細胞遷移的促進作用(

F

=62.60、74.67，

P

<0.01、<0.001，

F

=317.25、157.23,均

P

48 <0

.

001)。Transwell實驗結果見圖6：與對照組比較，24 h各組相對遷移率分別為(1.41±0.08)、(0.69±0.13)、(0.44±0.15)；48 h各組相對遷移率分別為(1.21±0.09)、(0.42±0.12)、(0.54±0.18)。與胰島素組比較，24 h ATPR和ML-7能抑制胰島素對BGC-823細胞遷移的促進作用(

F

=50.06、73.25，

P

<0

.

01、<0

.

001),48 h抑制現象更明顯(

F

=62.41、24.94，均

P

<0

.

001)。

圖5 細胞劃痕實驗探討ATPR抑制胰島素對BGC-823遷移能力的促進作用A:胰島素聯合ATPR以及ML-7抑制劑作用于BGC-823細胞48 h，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力的變化 ×200；B:細胞劃痕實驗結果統計圖；與對照組比較：**P<0.01;與胰島素組比較：##P<0.01，###P<0.001

圖6 Transwell劃痕實驗探討ATPR抑制胰島素對BGC-823遷移能力的促進作用A:胰島素聯合ATPR以及ML-7抑制劑作用于BGC-823細胞48 h，Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力的變化 ×200；B:Transwell實驗結果統計圖;與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與胰島素組比較：##P<0.01，###P<0.001

2.5 ATPR調控MLCK和Claudin 18蛋白表達

為探究ATPR抑制胰島素對BGC-823細胞遷移促進作用的分子機制，我們檢測遷移相關蛋白MLCK和Claudin 18表達水平，結果見圖7。24 h各處理組MLCK蛋白表達水平分別為(0.64±0.10)、(0.89±0.12)、(0.75±0.01)、(0.33±0.10)；Claudin 18蛋白表達水平分別為(0.92±0.12)、(0.30±0.09)、(0.88±0.19)；48 h各處理組MLCK蛋白表達水平分別為(0.62±0.05)、(0.82±0.11)、(0.39±0.13)、(0.48±0.01)；Claudin 18蛋白表達水平分別為(0.93±0.21)、(0.16±0.06)、(0.73±0.15)。與對照組比較，胰島素能明顯促進MLCK表達并抑制Claudin 18表達(

F

=13.92、38.44，

P

<0.05、<0.01;

F

=20.81、27.97,

P

<0.05、<0.01)；ATPR和ML-7能抑制MLCK表達(

F

=28.92、33.84，

P

>0.05、<0.01;

F

=14.35、21.32,

P

<0.05、<0.01)，同時ATPR促進Claudin 18表達(

F

=17.12，

P

<0.01;

F

=28.01，

P

<0.01)。結果提示，ATPR通過抑制MLCK表達并促進Claudin 18表達抑制胰島素對BGC-823細胞遷移的促進作用。

圖7 ATPR抑制胰島素對BGC-823遷移能力促進作用的機制A：胰島素聯合ATPR以及ML-7抑制劑作用于BGC-823細胞24、48 h，Western blot檢測MLCK蛋白表達水平; B：MLCK蛋白表達水平統計圖；C：胰島素聯合ATPR作用于BGC-823細胞24、48 h，Western blot檢測Claudin 18蛋白表達水平；D：Claudin 18蛋白表達水平統計圖；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與胰島素組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

本研究探討了在高水平胰島素條件下,ATPR對人胃癌細胞BGC-823遷移的抑制作用及其機制。我們的研究結果表明，ATPR通過降低BGC-823細胞中MLCK的表達，同時增加胃特異性緊密連接蛋白Claudin 18的表達，逆轉了高水平胰島素對BGC-823細胞遷移的影響，從而發揮了抗遷移的作用。

研究提示，代謝紊亂可能在胃癌的發生發展中起重要作用。與沒有代謝綜合征的胃癌患者比較，患有代謝綜合征的胃癌患者預后更差。代謝綜合征具有共同的病理基礎，即胰島素抵抗和高胰島素血癥。高胰島素血癥患者的血胰島素水平比正常人高得多，一般認為空腹血清胰島素≥85 pmol/L為高水平胰島素，轉換后相當于0.5 ng/ml。在我們的研究中，用該濃度的胰島素刺激48 h后，胃癌細胞的遷移能力明顯提高，而細胞的增殖能力未見明顯增加；在胰島素濃度達到10.0 ng/ml時，才觀察到其促進胃癌細胞的增殖，說明胰島素對胃癌細胞運動能力的促進作用明顯高于對增殖能力的影響。

ATRA具有多種生理學作用，包括保護皮膚和抗腫瘤。作為ATRA的人工合成衍生物之一，ATPR顯示了優異的抗腫瘤作用，本研究觀察到在高水平胰島素作用下ATPR依舊可以發揮抗胃癌細胞遷移的作用；且與MLCK特異性藥物抑制劑(ML-7)作用類似。MLCK是肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)磷酸化的主要酶之一，MLC的磷酸化被認為可以促進肌球蛋白組裝，增加基于肌球蛋白的收縮能力，肌球蛋白參與產生細胞遷移的收縮力，收縮力推動細胞體向前運動，細胞的后部與基質分離。而胰島素信號軸可通過MLCK促進MLC的磷酸化，我們的結果也表明高水平胰島素刺激下，胃癌細胞遷移能力增加的同時MLCK蛋白的表達升高，但是聯合ATPR作用后胃癌細胞遷移能力下降且MLCK蛋白的表達降低，提示ATPR可能通過抑制MLCK蛋白的表達逆轉了高水平胰島素對BGC-823細胞遷移的影響。

另一方面，MLC磷酸化誘導的細胞骨架收縮可調節緊密連接屏障功能。Claudins是緊密連接復合體的主要元素，Claudins在腫瘤組織中的表達及在細胞中分布異常已被廣泛證實，并與腫瘤進展和轉移相關。Claudin 18主要表達于胃上皮細胞，在胃癌中經常下調。我們的數據顯示，在胰島素處理后，胃癌細胞中Claudin 18蛋白表達明顯下降；而聯合ATPR處理后Claudin 18表達較胰島素組明顯升高，提示ATPR可能通過上調Claudin 18表達來增強緊密連接，從而逆轉胰島素的促遷移作用。

綜上所述,ATPR能逆轉高水平胰島素對胃癌細胞BGC-823遷移的促進作用，可能與其抑制胰島素對MLCK和Claudin 18的調控密切相關。然而高胰島素血癥下腫瘤細胞的遷移機制極其復雜，要為合并代謝綜合征的胃癌患者開發新的治療藥物還需更深更進一步的探討。