抑制miR-128-3p表達對油酸致大鼠肺損傷的保護作用研究

龍光文，張 謙，楊秀林，吉春玲，董裕康

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是一種非心源性因素誘發的急性肺水腫，是以嚴重低氧血癥、呼吸窘迫、肺順應性下降為主要臨床特征的肺部急性炎癥性綜合征。MicroRNA(miRNA)是一類長度為20～25個核苷酸的非編碼RNA分子，主要參與調控細胞增殖、遷移及凋亡等過程。近些年的研究顯示，miRNA可以作為ARDS診斷的生物標志物或治療靶點。且Huang et al研究發現，miR-128-3p在ARDS大鼠模型肺組織中高表達。提示，miR-128-3p在ARDS疾病發生過程中可能起重要作用，但其作用機制還有待進一步探討。該研究擬通過尾靜脈注射油酸的方法建立肺損傷大鼠模型，探討miR-128-3p在肺損傷大鼠肺組織中的表達變化及下調miR-128-3p表達對模型大鼠肺組織的保護作用及可能作用機制，以期從基因層面為ARDS治療提供理論依據及新的小分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性SD大鼠100只，鼠齡6～7周，體質量(220±10)g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證：SCXK(黔)2018-0001。油酸購自湖南長沙恒昌化工有限公司；miR-128-3p拮抗劑(antagomir)及其陰性對照(antagomir NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；Nrf2抑制劑ML385購自美國Selleck公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；組織活性氧(reactive oxide species，ROS)檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；E2相關因子2(E2 related factor 2，Nrf2)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1

動物造模與分組 100只SD大鼠隨機分成假手術組(sham組)、模型組(Model組)、antagomir NC組(NC組)、miR-128-3p antagomir組(antagomir組)和miR-128-3p antagomir+Nrf2抑制劑ML385組(antagomir+ML385組)，每組20只。其中antagomir組和NC組在造模前1 h，采用微量注射器經頸部氣管注射antagomir或antagomir NC(根據相關文獻和預實驗結果確定給予劑量為40 nmol/只)，antagomir+ML385組在antagomir組的基礎上給予30 mg/kg ML385腹腔注射，而sham組和Model組注射等量生理鹽水。隨后除sham組，其他各組大鼠均參考文獻采用尾靜脈注射油酸(0.15 ml/kg)的方法建立肺損傷模型。造模后若大鼠呼吸頻次增加，動脈血液氧合指數(oxygenation index，OI)<200 mmHg，表明造模成功。造模成功24 h后處死大鼠，收集樣本檢測。

1.2.2

動脈血氧分壓(partial pressure of oxygen，PaO)、OI測定 分離大鼠股動脈，取股動脈血1 ml，立即進行血氣分析，記錄PaO，根據吸入氣中的氧濃度分數(fraction of inspiration O，FiO)計算OI，OI=PaO/FiO。

1.2.3

肺組織濕/干重比值(W/D)計算 取大鼠右肺中葉組織，濾紙吸干表面水分，稱濕重(W)，將肺組織置于80 ℃烘箱72 h至恒重，稱其干重(D)，計算肺組織W/D。

1.2.4

ELISA檢測肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量 實驗結束后結扎各組大鼠右主支氣管，用4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)灌洗支氣管肺泡，反復灌洗3次并收集BALF，采用ELISA法檢測BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量，按照試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的光密度(optical density，OD)值，根據標準曲線計算各指標含量。

1.2.5

比色法測定肺組織中SOD活性及MDA和ROS水平 收集各組大鼠左肺部分組織，根據RIPA裂解液使用說明書制備肺組織勻漿，用玻璃勻漿器上下、旋轉充分碾磨，在冰上充分裂解后于12 000 r/min離心20 min取上清液，按照試劑盒操作說明書加入相應試劑，孵育后測各樣品吸光度值，根據說明書提供的計算公式分別計算肺組織中SOD活性及MDA和ROS水平。

1.2.6

蘇木精

-

伊紅染色法(hematoxylin

-

eosin staining，HE)觀察肺組織病理變化及評分 取大鼠右肺下葉，10 %甲醛固定，沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋后切片，HE染色，光鏡下觀察病理學結果，并對肺損傷程度進行評分：從肺泡水腫、肺間質水腫、中性粒細胞浸潤、肺泡充血4個方面，損傷程度由輕到重依次標記為0、1、2、3、4分，累計總分為最終損傷評分。

1.2.7

反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測肺組織中miR-128-3p表達水平以及Nrf2和HO-1的mRNA水平 取各組大鼠的適量左肺組織，采用TRIzol法提取各樣本的總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，取總RNA 2 μg 按照逆轉錄試劑盒提供的方法合成cDNA，引物序列見表1。取10 μl逆轉錄產物進行PCR反應，反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環。以U6和GAPDH為內參，采用2法計算各基因mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.2.8

Western blot檢測肺組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達水平 收集各組大鼠部分左肺組織用于蛋白質提取，采用BCA法測定肺組織中蛋白濃度。

向SDS-PAGE通道中加入等體積蛋白質，并將蛋白質轉移到PVDF膜上，隨后5%脫脂牛奶封閉。PBS洗滌3次，加入一抗Nrf2、HO-1和GAPDH一起孵育過夜，PBS洗滌后，將膜進一步與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗一起孵育，通過增強的化學發光法使膜上的條帶可視化。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度分析，以GAPDH為內參計算各蛋白相對表達量。

1.2.9

熒光素酶報告實驗檢測miR-128-3p與Nrf2的靶向作用關系 利用TargetScan軟件預測miR-128-3p和Nrf2 mRNA上的結合位點，構建miR-128-3p結合位點的Nrf2野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報告基因質粒，分別與miR-128-3p mimic或miR-NC共轉染至293T細胞中。轉染48 h后，根據雙熒光素酶報告基因試劑盒說明進行測定，用螢火蟲熒光素酶活性和腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對活性。

2 結果

2.1 抑制miR-128-3p表達對各組大鼠動脈PaO

、OI以及肺組織W/D值的影響

與sham組比較，Model組大鼠肺組織W/D值增加，PaO和OI值降低，差異有統計學意義(

P

<0.01)；與Model組比較，antagomir組大鼠肺組織W/D值降低，PaO和OI值增加，差異有統計學意義(

P

<0.01)，而NC組差異無統計學意義(

P

>0.05)；與antagomir組比較，antagomir+ML385組大鼠肺組織W/D值增加，而PaO和OI值降低，差異有統計學意義(

P

<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠動脈PaO2、OI以及肺組織W/D比較

2.2 抑制miR-128-3p表達對各組大鼠肺組織中miR-128-3p表達水平的影響

與sham組比較，Model組大鼠肺組織中miR-128-3p表達水平上升，差異有統計學意義(

P

<0.01)；與Model組比較，antagomir組大鼠肺組織中miR-128-3p表達水平降低，差異有統計學意義(

P

<0.01)，而NC組差異無統計學意義(

P

>0.05)；與antagomir組比較，antagomir+ML385組大鼠肺組織中miR-128-3p表達水平無統計學意義(

P

>0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織中miR-128-3p表達水平比較1：sham組; 2：Model組; 3：NC組; 4：antagomir組; 5：antagomir+ML385組；與sham組比較：**P<0.01；與Model組比較：##P<0.01

2.3 抑制miR-128-3p表達對各組大鼠BALF中相關因子含量的影響

與sham組比較，Model組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量上升，差異有統計學意義(

P

<0.01)；與Model組比較，antagomir組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量降低，差異有統計學意義(

P

<0.01)，而NC組差異無統計學意義(

P

>0.05)；與antagomir組比較，antagomir+ML385組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量上升，差異有統計學意義(

P

<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較

2.4 抑制miR-128-3p表達對各組大鼠肺組織中氧化應激水平的影響

與sham組比較，Model組大鼠肺組織中MDA和ROS水平上升，SOD活性下降，差異有統計學意義(

P

<0.01)；與Model組比較，antagomir組大鼠肺組織中MDA和ROS水平下降，SOD活性上升，差異有統計學意義(

P

<0.01)，而NC組差異無統計學意義(

P

>0.05)；與antagomir組比較，antagomir+ML385組大鼠肺組織中MDA和ROS水平上升，SOD活性下降(

P

<0.01)，差異有統計學意義(

P

<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠肺組織中SOD、MDA和ROS水平比較

2.5 抑制miR-128-3p表達對各組大鼠肺組織病理學的影響

sham組大鼠肺組織結構完整，未見明顯異常；Model組、NC組和antagomir+ML385組大鼠肺組織損傷嚴重，表現為間質水腫，肺泡萎陷、肺泡壁增大甚至出血，有肺透明膜形成；antagomir組大鼠肺組織結構相對完整，肺泡和間質腫脹程度明顯減輕，較少炎癥細胞出現，肺泡出血不明顯。與sham組比較，Model組大鼠肺損傷評分增加，差異有統計學意義(

P

<0.01)；與Model組比較，antagomir組大鼠肺損傷評分降低，差異有統計學意義(

P

<0.01)，而NC組差異無統計學意義(

P

>0.05)；與antagomir組比較，antagomir+ML385組大鼠肺損傷評分增加，差異有統計學意義(

P

<0.01)。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理學觀察 HE×2001：sham組; 2：Model組; 3：NC組; 4：antagomir組; 5：antagomir+ML385組；與sham組比較：**P<0.01；與Model組比較：##P<0.01；與antagomir組比較：★★P<0.01

2.6 抑制miR-128-3p表達對各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1表達水平的影響

與sham組比較，Model組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(

P

<0.01)；與Model組比較，antagomir組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(

P

<0.01)，而NC組差異無統計學意義(

P

>0.05)；與antagomir組比較，antagomir+ML385組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(

P

<0.01)。見圖3。

圖3 各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表達水平比較A：RT-PCR檢測基因mRNA水平；B：Western blot檢測基因蛋白表達水平； 1：sham組; 2：Model組; 3：NC組; 4：antagomir組; 5：antagomir+ML385組；與sham組比較：**P<0.01；與Model組比較：##P<0.01；與antagomir組比較：★★P<0.01

2.7 miR-128-3p與Nrf2的靶向作用關系

如圖4A的miRNAs靶基因預測軟件(TargetScan)分析結果顯示，miR-128-3p在Nrf2基因3′-UTR區域存在靶向結合位點。如圖4B的熒光素酶報告基因實驗結果進一步證實，miR-128-3p顯著降低野生型Nrf2熒光素酶活性(

P

<0.01)，而對突變型Nrf2熒光素酶活性無影響(

P

>0.05)。表明miR-128-3p與Nrf2確實存在靶向作用關系。

圖4 miR-128-3p與Nrf2的靶向關系A：TargetScan預測miR-128-3p在Nrf2 3′-UTR區域的靶向結合位點；B：雙熒光素酶實驗證實miR-128-3p和Nrf2的結合關系;與NC組比較：**P<0.01

3 討論

ARDS是威脅著人類健康的肺部急性炎癥性綜合征，目前無特異性和有效的治療方法，miRNAs的發現，將成為ARDS潛在的診斷新指標和治療新靶點。近些年來，不少學者用不同的ARDS動物模型篩選出了有表達差異的miRNAs，來探索miRNAs對ARDS的調控作用。Huang et al通過高潮氣量機械通氣法建立大鼠ARDS模型，發現miR-24和miR-26a等表達下調，而miR-128-3p、miR-127和miR-135b等表達顯著上調，暗示它們在ARDS的發病過程中可能有重要的調節作用。miR-128-3p在多種組織中表達，但其功能研究相對較少，有研究報道miR-128-3p具有調控脂肪生成和脂肪分解、保護心肌細胞、保護神經、抑制炎癥反應和抗腫瘤等多種生理作用，但miR-128-3p在ARDS中的作用及機制尚不明確。本研究通過構建肺損傷大鼠模型，經頸部氣管注射miR-128-3p抑制劑來探討miR-128-3p對大鼠肺組織的保護作用及可能作用機制，研究結果顯示，miR-128-3p在模型大鼠肺組織中高表達，抑制miR-128-3p表達可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，增強機體抗氧化能力，從而改善模型大鼠肺損傷。

本研究通過尾靜脈注射油酸(0.15 ml/kg)的方法建立肺損傷大鼠模型，結果顯示，模型大鼠動脈OI<200 mmHg，同時肺W/D比值較Sham組升高，肺組織HE染色結果顯示肺部結構明顯損傷、肺泡腔萎陷、出血，肺泡壁明顯增厚，有大量紅細胞滲出，與前人研究結果一致，提示模型制備成功。進一步通過RT-PCR檢測大鼠肺組織中miR-128-3p表達，發現模型大鼠肺組織中miR-128-3p表達水平明顯升高，提示miR-128-3p在ARDS可能發揮著重要作用。為進一步驗證其具體作用，本研究通過頸部氣管注射的方式給模型大鼠注射miR-128-3p抑制劑miR-128-3p antagomir，結果顯示模型大鼠肺組織miR-128-3p表達水平下調，同時肺組織病理性改變明顯減輕，肺W/D比值降低，提示抑制miR-128-3p表達可緩解模型大鼠肺組織損傷。

ARDS的主要發病機制之一就是各種病因誘發的肺內或全身過度炎癥反應，肺內炎癥反應會造成內皮細胞和上皮細胞損傷，導致肺泡毛細血管通透性增高，從而使肺組織換氣功能惡化引起低氧血癥，導致嚴重肺水腫，引起蛋白滲出導致肺透明膜形成。TNF-α、IL-1β和IL-6等細胞炎癥因子整體水平變化而導致肺內皮、上皮屏障損傷是ARDS的主要特征之一，這些炎癥因子可反映機體的免疫情況，作為反映肺組織損傷嚴重程度的指標。近年來研究發現，增強抗氧化能力，抑制氧化應激是干預ARDS的重要的策略之一。SOD、MDA和ROS是氧化應激損傷的標志物，其含量可反映機體清除氧自由基的能力。本研究對各組大鼠BALF中炎性因子含量以及肺組織中的氧化應激水平進行了檢測，研究結果顯示：與Sham組比較，Model組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量以及ROS和MDA水平增加，SOD活性下降，說明機體內的氧化與抗氧化平衡被打破，產生氧化應激損傷，與馮敏等研究結果一致。抑制miR-128-3p表達可顯著降低BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，以及ROS和MDA水平，增加SOD活性，提示抑制miR-128-3p表達可通過降低肺部炎癥反應，減輕機體氧化應激損傷來改善模型大鼠肺損傷。

Nrf2/HO-1信號通路是細胞內經典的抗氧化應激通路，其激活可降低氧化應激損害起到保護細胞的作用。進一步探究抑制miR-128-3p表達可增強肺損傷大鼠抗氧化能力的具體作用機制，本研究對各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1的表達水平進行了檢測，研究結果顯示：與Sham組比較，Model組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1的表達水平降低，抑制miR-128-3p表達可增加Nrf2和HO-1在肺組織中的表達水平，進一步在抑制miR-128-3p表達的基礎上對模型鼠腹腔注射Nrf2抑制劑ML385，發現Nrf2和HO-1的表達水平又隨之下降。而通過生物信息預測發現，miR-128-3p基因序列上存在Nrf2的結合位點，進一步通過熒光素酶報告實驗確定了miR-128-3p能靶向調控Nrf2的表達。說明抑制miR-128-3p表達確可通過促進模型大鼠肺組織中Nrf2/HO-1信號通路的激活，增強其抗氧化能力，從而減輕大鼠肺損傷。

綜上所述，抑制miR-128-3p表達可顯著減輕大鼠的肺損傷，其作用機制可能與通過靶向調控Nrf2表達，促進Nrf2/HO-1信號通路激活，抑制肺組織炎癥反應有關，該研究結果可為ARDS臨床治療藥物的研發提供實驗依據。