胃癌TS表達(dá)及雷替曲塞腹腔給藥對(duì)其影響研究

黃志國(guó), 胡孔旺, 李龍龍, 馮振游

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。胃癌腹腔化療以經(jīng)驗(yàn)用藥為主，雷替曲塞、5-氟尿嘧啶等藥物在胃癌中均有應(yīng)用。腹腔化療術(shù)中給藥最為常用，但是手術(shù)使腹膜腔結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，此時(shí)用藥會(huì)使藥物存留時(shí)間縮短，濃度降低，術(shù)后腹腔粘連也會(huì)干擾腹腔內(nèi)藥物循環(huán)，術(shù)前用藥可能更為有效。胸苷酸合成酶(thymidine synthase，TS)是胸苷酸合成及DNA復(fù)制的關(guān)鍵酶，也是雷替曲塞發(fā)揮作用的生物靶點(diǎn)。有研究顯示，在肺腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等組織中，TS陰性患者預(yù)后更好，然而胃癌中TS的表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議。該研究就胃癌中TS表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系，雷替曲塞腹腔給藥對(duì)TS表達(dá)的影響，雷替曲塞術(shù)前腹腔給藥最適時(shí)間等問(wèn)題進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科2011年1月—2012年1月收治的具有完整隨訪資料和臨床病理信息的60例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本行免疫組化檢測(cè)。另收集2019年2—8月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科一病區(qū)行腹腔鏡手術(shù)胃癌患者40例，其中手術(shù)結(jié)束給藥組的20例胃癌患者的新鮮癌及癌旁組織同時(shí)行ELISA、免疫組化及q-PCR檢測(cè)。患者入組標(biāo)準(zhǔn)：①Ⅰ期以外具有病理診斷的胃癌患者；② 心肺肝腎功能正常；③ 此次入院治療前未行任何放、化療治療；④ 自愿參加本次研究并簽署知情同意書，積極配合后期隨訪。另收集30例同期未行腹腔給藥的患者，入組標(biāo)準(zhǔn)同上，采集患者入院前血液測(cè)量TS濃度，用于分析血液中TS濃度與臨床病理因素的關(guān)系。本研究所有患者隨訪自術(shù)后開(kāi)始，術(shù)后第一年每2個(gè)月隨訪1次；術(shù)后第二年每3個(gè)月隨訪1次；第二年以后每半年隨訪1次。隨訪截止于2020年7月，本研究符合安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到該委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1

免疫組化 免疫組化檢測(cè)胃癌和癌旁組織TS表達(dá)：石蠟切片置于烤箱中98 ℃下烤片，二甲苯和不同濃度乙醇脫蠟至水化，放入微波爐中抗原修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷，血清封閉，一抗稀釋液稀釋(1 ∶100，美國(guó)CST公司)，4 ℃過(guò)夜；二抗(生物素標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG，1 ∶1 000)室溫孵育； DAB顯色；蘇木精染色，中性樹(shù)脂封固；兩位副高以上病理科醫(yī)師雙盲閱片，獨(dú)立評(píng)分。

1.2.2

q

-

PCR 用TRIzol試劑盒從新鮮癌及癌旁組織中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)，TS基因的引物序列中正向引物為：5′-GCCTCGGTGTGCCTTTCA-3′，反向引物為：5′-CCCGTGATGTGCGCAAT-3′。根據(jù)每個(gè)樣本Ct值算出平均值，再計(jì)算TS的相對(duì)表達(dá)量2，同組內(nèi)參基因作為對(duì)照，每個(gè)樣本3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.3

ELISA ELISA檢測(cè)新鮮血液和組織中TS濃度。血液標(biāo)本2 000 r/min、4 ℃下離心20 min后收集上清液待測(cè)，組織標(biāo)本1 ∶9加入PBS冰浴勻漿后5 000 r/min、4 ℃條件下離心取上清液待測(cè)；根據(jù)說(shuō)明書逐步操作，計(jì)算出每個(gè)樣本TS濃度。ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.2.4

腹腔化療 40例行腹腔鏡根治性手術(shù)并接受腹腔化療的胃癌患者按隨機(jī)數(shù)字表法平均分為2組：① 術(shù)前2 d給藥組；② 手術(shù)結(jié)束給藥組。術(shù)前2 d給藥組由具有正高職稱的外科醫(yī)師采用腹腔灌注的方式給藥，手術(shù)結(jié)束給藥組在手術(shù)結(jié)束關(guān)腹前把藥物溶于100 ml生理鹽水后灑入腹腔腫瘤切除部位同時(shí)夾閉腹腔引流管6 h。腹腔化療藥物均選擇雷替曲塞(南京正大天晴制藥有限公司，批號(hào)：20180525)。收集患者給藥前后連續(xù)7 d晨血用于TS檢測(cè)；手術(shù)標(biāo)本離體后留取癌及5 cm以外的癌旁組織測(cè)量TS濃度。

1.3 結(jié)果判斷

免疫組化結(jié)果采用腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞比例和著色強(qiáng)度綜合判斷評(píng)分：① 腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1分為<25%，2分為25%～50%，3分為<50%～75%，4分為>75%；② 腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度：0分為不著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。根據(jù)兩項(xiàng)結(jié)果相乘：0～5分為陰性，6～8分為陽(yáng)性。ELISA結(jié)果：根據(jù)酶標(biāo)儀吸光度(optical density, OD)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本TS濃度。雷替曲塞術(shù)前2 d及手術(shù)結(jié)束給藥組患者療效觀察指標(biāo)：無(wú)病生存率。

2 結(jié)果

2.1 TS在胃癌和癌旁組織中表達(dá)

TS在胃癌組織中的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。80例胃癌組織中，TS陽(yáng)性表達(dá)率為48.75%(39/80)，80例癌旁組織中，TS陽(yáng)性表達(dá)率為23.75%(19/80)，胃癌組織TS陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ=10.818，

P

<0.001，表1)。

圖1 TS在胃癌中的表達(dá) SP×400A：無(wú)表達(dá)；B：低表達(dá)；C：中等表達(dá)；D：高表達(dá)

表1 胃癌和癌旁組織中TS表達(dá)的卡方分析結(jié)果(n)

2.2 ELISA檢測(cè)TS在新鮮胃癌和癌旁組織中的表達(dá)

20例新鮮胃癌組織TS平均濃度為(1.105×10±0.177×10)μmol/L，對(duì)應(yīng)癌旁組織TS平均濃度為(0.811×10±0.192×10)μmol/L。新鮮胃癌組織中TS濃度高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=5.467，

P

<0.001，圖2)。

圖2 新鮮胃癌與癌旁組織中TS的表達(dá)量與癌旁組織比較：***P<0.001

2.3 q-PCR檢測(cè)TS mRNA在新鮮胃癌及癌旁組織的表達(dá)

20例新鮮胃癌及癌旁組織TS mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示：TS mRNA在新鮮胃癌組織(3.08±1.70)相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織(1.02±0.23)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=5.228，

P

<0.001, 圖3)。

圖3 新鮮胃癌與癌旁組織中TS mRNA的表達(dá)量與癌旁組織比較：***P<0.001

2.4 TS在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

TS在胃癌組織中的表達(dá)與性別等因素?zé)o關(guān)；與腫瘤分化程度相關(guān)，腫瘤分化程度越高TS陽(yáng)性率越低(

P

<0.05，表2)。

表2 胃癌組織中TS表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系(n=80)

2.5 TS表達(dá)與胃癌生存率的關(guān)系

胃癌患者生存分析結(jié)果(圖4)顯示：TS陰性胃癌患者生存期較陽(yáng)性患者長(zhǎng)(

P

<0.001)。5年以上隨訪周期的60例胃癌患者中：TS陰性患者3年和5年生存率分別為74.19%和54.84%；TS陽(yáng)性患者3年和5年生存率分別為48.28%和27.59%。COX單因素回歸分析結(jié)果顯示腫瘤大小、TNM分期、分化程度和TS表達(dá)與臨床預(yù)后相關(guān)(

P

<0.05，表3)，COX多因素回歸分析顯示只有腫瘤大小、分化程度和TS表達(dá)為影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(

P

<0.05，表3)。

表3 COX回歸模型對(duì)80例胃癌患者的單因素和多因素生存分析結(jié)果

圖4 Kaplan-Meier法分析80例胃癌患者癌組織中TS表達(dá)情況與總生存期的關(guān)系

2.6 TS在胃癌患者血液中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

TS在胃癌患者血液中的表達(dá)與性別等因素?zé)o關(guān)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)越低、腫瘤分化程度越高TS陽(yáng)性率越低(

P

<0.05，表4)。

表4 胃癌患者血液中TS表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系(n=30)

2.7 雷替曲塞腹腔給藥后血液中TS濃度的變化趨勢(shì)

雷替曲塞腹腔給藥后TS濃度降低，且血液中TS濃度在給藥后的第2天降至最低值，然后逐漸上升(圖5)。

圖5 胃癌患者雷替曲塞腹腔化療給藥前后血液中TS濃度的變化

2.8 術(shù)前2 d給藥組和手術(shù)結(jié)束給藥組總生存率和無(wú)病生存率

術(shù)前2 d給藥組患者1年生存率為75%(15/20)，手術(shù)結(jié)束給藥組1年生存率為80%(16/20)，兩組患者術(shù)后總生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；截止隨訪日，兩組患者無(wú)病生存率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

P

<0.05，圖6)，且術(shù)前2 d給藥組患者具有更高的無(wú)病生存率。

圖6 雷替曲塞術(shù)前2 d和術(shù)中分別腹腔化療給藥治療胃癌患者后兩組無(wú)病生存率的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

TS是DNA從頭合成途徑中的關(guān)鍵酶，作為化療藥物作用靶點(diǎn)被廣泛研究。本實(shí)驗(yàn)免疫組化和ELSA結(jié)果均表明TS蛋白在胃癌和癌旁組織存在差異表達(dá)，且在癌組織中表達(dá)更高； TS mRNA分析結(jié)果也顯示出相同趨勢(shì)。但是TS在胃癌中表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系一直存在爭(zhēng)議。Rogoza-Mateja et al免疫組化研究結(jié)果顯示，TS的表達(dá)與手術(shù)患者生存預(yù)后無(wú)關(guān)；Wang et al的一項(xiàng)meta分析顯示，雖然TS陰性患者表現(xiàn)出具有更長(zhǎng)生存時(shí)間的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kim et al結(jié)果均顯示TS陽(yáng)性的胃癌患者具有更差的預(yù)后。本研究對(duì)80例術(shù)前未行放、化療的胃癌患者的總體生存分析結(jié)果顯示： TS陰性患者的生存時(shí)間顯著高于TS陽(yáng)性患者的生存時(shí)間。其中60例具有5年以上隨訪周期者生存率分析結(jié)果顯示：TS陰性胃癌患者3年和5年生存率均高于TS陽(yáng)性患者。本研究首次報(bào)道了TS陰性和陽(yáng)性的胃癌患者5年生存率的對(duì)比。

本次研究還分析了胃癌患者血液中TS基礎(chǔ)濃度與臨床病理因素的關(guān)系，結(jié)果顯示胃癌患者血液中TS濃度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度存在相關(guān)性，因此研究血液中TS與胃癌的關(guān)系具有重要意義。胃癌腹腔化療用藥方案和用藥時(shí)間尚無(wú)定論，雷替曲塞用于胃癌腹腔化療的安全性和有效性均有研究報(bào)道，且雷替曲塞具有活性高、半衰期長(zhǎng)、有效作用時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。在用藥時(shí)間的研究中，術(shù)前腹腔給藥可能比術(shù)中和術(shù)后腹腔給藥更具藥代動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)，但是術(shù)前腹腔給藥具體時(shí)間未見(jiàn)報(bào)道。

TS是雷替曲塞發(fā)揮作用的生物靶點(diǎn)，但是雷替曲塞腹腔給藥后血液中TS濃度的動(dòng)態(tài)變化尚無(wú)報(bào)道。本研究對(duì)雷替曲塞腹腔給藥的胃癌患者用藥前后血液中TS濃度分析顯示：給藥前血液中TS濃度最高，給藥后TS濃度降低，給藥后第2天達(dá)最低值，后從給藥后第3天開(kāi)始TS濃度又逐漸上升。胃癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是多種因素共同影響的結(jié)果，但術(shù)中脫落的癌栓及腹腔內(nèi)的游離癌細(xì)胞隨血液循環(huán)到達(dá)全身各處是重要原因之一。雷替曲塞術(shù)前2 d腹腔給藥可使手術(shù)當(dāng)天血液中TS濃度降到最低值，此時(shí)血液循環(huán)中癌細(xì)胞最大程度被抑制而難以復(fù)制生長(zhǎng)，可以有效預(yù)防胃癌患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，選擇術(shù)前2 d腹腔給藥作為雷替曲塞術(shù)前腹腔給藥的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究，比較其與臨床常用的術(shù)中給藥的效果差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雷替曲塞術(shù)前2 d給藥組具有更高的無(wú)病生存率。兩組患者術(shù)后無(wú)病生存率的差異表明：雷替曲塞術(shù)前2 d腹腔給藥能夠更好地預(yù)防胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。兩組患者總生存率尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能因隨訪周期太短導(dǎo)致，3年生存率和5年生存率更能反映患者預(yù)后生存情況。本研究小組將會(huì)繼續(xù)增加各組樣本量以開(kāi)展進(jìn)一步研究，同時(shí)會(huì)跟蹤隨訪兩組患者3年和5年生存率差異。

綜上所述，TS在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，TS具有作為胃癌患者生存預(yù)測(cè)標(biāo)志物的潛力，進(jìn)一步研究其涉及的分子機(jī)制可以為化療藥物的研發(fā)提供新思路。雷替曲塞腹腔給藥后血液中TS濃度變化趨勢(shì)可作為預(yù)測(cè)雷替曲塞最佳腹腔給藥時(shí)間的重要指標(biāo)。雷替曲塞術(shù)前2 d腹腔給藥可以更好的預(yù)防胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，但仍需更多的臨床樣本和長(zhǎng)期生存率進(jìn)行進(jìn)一步研究。