燈盞花素對血管性癡呆大鼠海馬CA1區病理改變及Nrf2/HO-1通路的影響

房娉平，闞敏宸，郭立靜，孫 濤，劉文杰，霍浩然

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由一系列腦血管疾病導致的一種嚴重的認知功能障礙綜合征，約占癡呆病人的20%，是僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類型，嚴重影響病人生活質量[1]。海馬CA1區是大腦認知功能腦區，腦缺血或長期血流低灌注所致海馬CA1區神經元損傷是VD的病理基礎[2-3]。病理生理學研究顯示，腦組織缺血缺氧所致氧化應激反應在VD發生發展過程中發揮著重要作用[4-5]。

隨著國家振興中醫藥戰略的實施及中醫藥現代化研究的深入，中藥治療VD逐漸得到醫患的關注與認可。燈盞花屬菊科多年生草本植物，是我國傳統中藥品種，性溫、味辛，具有發表散寒、消炎止痛之功效，目前臨床多用于心腦血管疾病的治療[6]。燈盞花素(Breviscapine，Bre)是中藥燈盞花的主要活性成分，具有良好的抗氧化活性[7]。核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶1(Nrf2/HO-1)通路在機體氧化應激反應中發揮著重要的調控作用[8]。本研究探討Bre對VD大鼠海馬CA1區病理學改變及Nrf2/HO-1通路的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠180只，8周齡，體質量220～250 g，購自河北醫科大學實驗動物學部[SYXK(冀)2018-004]，合格證號：20191204011。實驗前適應性飼養7 d[光照/黑暗12 h交替、溫度(25±1)℃、相對濕度(60±10)%]。

1.2 實驗藥物與試劑 燈盞花素注射液購自石藥銀湖制藥有限公司；尼莫地平注射液(nimodipine，NMP)購自揚子江藥業集團有限公司。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶標記技術(TUNEL)試劑盒、TriQuick Reagent總RNA提取試劑盒和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)試劑盒均購自北京索萊寶生物技術有限公司；反轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒購自上海novoprotein公司；Nrf2、HO-1、β-actin抗體和IgG二抗購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組、造模與給藥 將180只SD大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、Bre低劑量組(1mg/kg)、Bre中劑量組(2mg/kg)、Bre高劑量組(4 mg/kg)和NMP組(2 mg/kg)，每組30只。參考文獻[9]報道的方法，術前12 h禁食、自由飲水，采用鈍性分離并結扎雙側頸總動脈復制VD大鼠模型；假手術組分離雙側頸總動脈但不結扎。造模完成后，Bre各劑量組和NMP組均每日1次腹腔注射相應劑量藥物，假手術組和模型組每日1次腹腔注射生理鹽水，療程均為14 d[10]。

1.3.2 Morris水迷宮實驗測評學習記憶能力 將平臺固定于第3象限，水溫設置為(25±1)℃。治療完成后，隨機取各組10只大鼠，適應性訓練3 d并誘導大鼠找到位于第3象限平臺。①定位航行實驗：將每只大鼠分別從第1象限、第2象限、第4象限固定入水點頭朝器壁方向放入水中，記錄找到平臺的時間(120 s內未找到平臺則按120 s計算)，取平均值，即逃避潛伏期；②空間探索實驗：撤除第3象限平臺，于第1象限固定點頭朝器壁方向放入水中，記錄120 s時間內穿越平臺次數。逃避潛伏期和穿越平臺次數分別代表認知能力中的學習能力和記憶能力。

1.3.3 海馬區組織病理學檢查和海馬神經元凋亡狀況觀察 麻醉后脊椎脫臼處死，斷頭取腦并去除小腦、腦干后，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，梯度乙醇脫水和二甲苯透明后行石蠟包埋、4 μm厚度切片，梯度乙醇脫蠟水化。①行常規蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片后通過光學顯微鏡觀察海馬區組織病理學改變；②參照TUNEL試劑盒說明進行處理，50%甘油封片后觀察神經元凋亡狀況；凋亡指數(apoptosis index，AI)計算：每只大鼠分別取10張TUNEL染色切片，觀察顯微鏡下細胞總數和凋亡細胞數，AI(%)=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

1.3.4 電子顯微鏡觀察海馬神經元超微結構 隨機取各組10只大鼠，麻醉后開胸暴露心臟，由“左心室-右心耳”通路依次灌注300 mL生理鹽水和4%多聚甲醛溶液300 mL，斷頭取腦并剝離海馬體，切割成1 mm3后置于4 ℃濃度3%戊二醛溶液中固定2 h，梯度乙醇脫水、還氧丙烷置換、環氧樹脂Epon812浸透、包埋、60 nm超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，采用電子顯微鏡觀察海馬神經元超微結構。

1.3.5 生化分子法檢測海馬組織MDA含量和SOD、過氧化氫酶(CAT)活性 取各組剩余的10只大鼠，麻醉后脊椎脫臼處死、斷頭取腦并剝取海馬組織，稱量左側海馬組織并加入9倍量4 ℃裂解液后研磨勻漿，4 ℃離心(離心半徑10 cm，轉速3 500 r/min，時間5 min)后取上清液，按照試劑盒說明，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，分別采用黃嘌呤氧化法、鉬酸銨法檢測SOD、CAT活性。

1.3.6 免疫印跡法(Western Blotting)檢測海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達 取海馬組織勻漿液，4 ℃行兩次離心(6 000 r/min、離心10 min，取上清液；12 000 r/min、離心30 min，取沉淀)，Bradford法測定總蛋白含量，95 ℃水浴使蛋白變性，以30 μg蛋白量上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h、滴加目標蛋白和β-actin一抗4 ℃孵育過夜、洗膜后滴加IgG二抗室溫孵育2 h，滴加電化學發光(ECL)顯色并采用凝膠成像儀形成條帶；通過條帶灰度值，以β-actin為內參計算目標蛋白相對表達量。

1.3.7 逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測海馬組織Nrf2mRNA、HO-1mRNA表達 取右側海馬組織頭部0.1 g，采用TriQuick Reagent總RNA提取試劑盒分離純化總RNA，通過核酸分析儀檢測RNA濃度和純度后，按照逆轉錄試劑盒操作說明將RNA逆轉錄成cDNA。按照RT-PCR試劑盒操作說明進行RT-PCR擴增，設置RT-PCR程序為94 ℃反應30 s、60 ℃反應30 s、72 ℃反應60 s，共40個循環，凝膠分析儀成像。以β-actin為內參，目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。Nrf2、HO-1、β-actin的RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠學習記憶能力比較 與假手術組比較，模型組逃逸潛伏期延長，穿越平臺次數減少(P<0.01)；與模型組比較，Bre中劑量組、Bre高劑量組和NMP組逃逸潛伏期縮短，穿越平臺次數增加(P<0.01)；與NMP組比較，Bre高劑量組逃逸潛伏期縮短，(P<0.05)，穿越平臺次數增加(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠學習記憶能力比較(±s)

2.2 各組大鼠海馬CA1區組織病理學改變 假手術組大鼠海馬CA1區神經元形態正常(圓形或橢圓形)，結構完整，排列整齊、層次清晰，核膜核仁邊界清晰。模型組海馬CA1區神經元數量減少，排列紊亂、層次減少，胞體呈三角形或多邊形，核膜、核仁邊界不清，胞核固縮深染等病理學改變，病理分級明顯提高。與模型組比較，Bre各劑量組和NMP組海馬CA1區病理學改變呈不同程度減輕，病理分級明顯降低。其中Bre高劑量組神經元排列較為整齊、層次清晰、形態較正常、結構較完整。詳見圖1。

圖1 各組大鼠海馬區組織病理學改變(HE，×200)

2.3 各組大鼠海馬CA1區神經元超微結構 假手術組大鼠海馬CA1區神經元胞膜、核膜完整，染色質分布均勻，線粒體結構清晰；模型組神經元胞膜腫脹破裂，胞核形態異常，核仁邊界不清，染色質固縮，異染色質增多，線粒體腫脹、分裂、嵴溶解消失等超微結構病變；與模型組比較，Bre各劑量組和NMP組上述超微結構病變不同程度減輕。詳見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區神經元超微結構(×10 000)

2.4 各組大鼠海馬CA1區神經元凋亡狀況 假手術組大鼠海馬CA1區可見極少量的凋亡神經元；與假手術組比較，模型組凋亡神經元明顯增多，AI升高[(47.26±7.94)%與(3.50±0.61)%，P<0.01]；與模型組比較，Bre各劑量組和NMP組凋亡神經元不同程度減少，Bre中劑量組、Bre高劑量組和NMP組AI降低[(22.39±4.85)%、(14.18±2.90)%、(17.45±3.11)%和(47.26±7.94)%，P<0.01]；與NMP組比較，Bre高劑量組AI降低[(14.18±2.90)%和(17.45±3.11)%，P<0.05]。詳見圖3。

圖3 各組大鼠海馬神經元凋亡狀況(TUNEL，×200)

2.5 各組大鼠海馬組織MDA含量和SOD、CAT活性比較 與假手術組比較，模型組海馬組織MDA含量升高，SOD、CAT活性降低(P<0.01)；與模型組比較，Bre中劑量組、Bre高劑量組和NMP組MDA含量降低，SOD、CAT活性升高(P<0.01)；與NMP組比較，Bre高劑量組MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠海馬組織MDA含量和SOD、CAT活性比較(±s)

2.6 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，Bre中劑量組、Bre高劑量組和NMP組Nrf2、HO-1蛋白表達升高(P<0.01)；與NMP組比較，Bre高劑量組Nrf2、HO-1蛋白表達升高(P<0.01)。詳見圖4、表4。

圖4 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達電泳圖

表4 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較(±s)

2.7 各組大鼠海馬組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達降低(P<0.01)；與模型組比較，Bre中劑量組、Bre高劑量組和NMP組Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達升高(P<0.01)；與NMP組比較，Bre高劑量組Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達升高(P<0.01)。詳見圖5、表5。

圖5 各組大鼠海馬組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達電泳圖

表5 各組大鼠海馬組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達比較(±s)

3 討 論

隨著人口老齡化加劇，腦血管疾病發病率升高，VD患病人數逐年增加，嚴重影響老年人生命健康和生活質量。病理生理學研究發現，腦血流低灌注引發氧化應激反應，導致腦組織損傷進行性加重是VD發生發展的關鍵機制[11]。大腦海馬CA1區與認知功能密切相關，也是對缺血缺氧敏感的腦區，因此，抑制氧化應激反應為靶點，尋找保護CA1區的新型藥物對改善VD預后具有重要的臨床意義。

Bre是中藥燈盞花的主要活性成分，具有良好的抗氧化活性。謝雄根等[10]研究顯示，Bre具有改善VD大鼠認知功能的作用，但其機制尚不明確。本研究采用國際認可的雙側頸動脈結扎法制備VD大鼠模型，腹腔注射燈盞花素進行治療并以臨床治療VD一線用藥尼莫地平為陽性對照藥物，Morris水迷宮實驗結果顯示：經Bre治療14 d后，VD大鼠逃逸潛伏期縮短且穿越平臺次數提高；且經Bre治療14 d后，能明顯改善海馬CA1區組織病變并降低病理分級，改善海馬CA1區神經元超微結構病變和神經元凋亡狀況，且Bre高劑量組優于NMP組，提示Bre對VD大鼠海馬CA1區病理改變及學習記憶能力具有保護作用。VD多繼發于腦卒中等腦血管疾病，血流持續低灌注使線粒體電子傳遞鏈受阻導致氧自由基(ROS)大量生成，以ROS為底物的SOD、CAT等抗氧化酶被過度消耗，致使ROS不能被還原代謝而蓄積，破壞核酸、DNA、蛋白質、多肽等生物大分子結構而誘導細胞凋亡[9]；ROS攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化生成MDA[12]；進而導致VD發生后海馬CA1區病變持續加重。

Nrf2是體內細胞普遍存在的一種核轉錄因子，Deshmukh等[13]研究顯示，Nrf2可誘導抗氧化酶轉錄與表達，從而對機體的機體氧化應激反應起到重要的調控作用。HO-1是Nrf2下游基因，氧化應激狀態下Nrf2被激活入核后將啟動HO-1轉錄表達而催化降解血紅素、一氧化氮等，抑制氧化應激損傷[14-15]。本研究結果顯示，經燈盞花素治療14 d后，能顯著降低VD大鼠海馬區組織MDA含量并提高SOD、CAT活性，明顯上調Nrf2、HO-1 蛋白和mRNA表達，提示Bre具有抑制VD大鼠海馬區組織氧化應激損傷的作用，可能與激活Nrf2/HO-1通路有關。

綜上所述，Bre對VD大鼠海馬CA1區病理改變和學習記憶能力具有保護作用，其機制可能與激活Nrf2/HO-1通路進而抑制氧化應激反應有關。VD的病理機制復雜，燈盞花素對VD的治療作用機制有待于進一步研究。