酒精性肝病mRNA異常表達譜的綜合分析

張國順 王素穎 王志源 尚華 吳貴愷 吳迪楊 王柳青 袁聚祥

(華北理工大學 1公共衛生學院，河北 唐山 063000；2附屬醫院消化內科；3唐山市傳染病院血液凈化科；4唐山市工人醫院消化科；5唐山市弘慈醫院消化科)

酒精性肝病(ALD)是一種由過度飲酒引起的疾病，包括脂肪變性、纖維化、酒精性肝炎(AH)、肝硬化及其并發癥〔1,2〕，只有30%的酒精消費者會發展成嚴重的ALD〔3，4〕。性別、肥胖、種族、代謝綜合征、肝炎病毒感染和吸煙等被報道為與ALD發生相關的危險因素〔5〕。ALD的主要治療方法是控制飲酒，改善生活方式，預防原發性和繼發性肝硬化并發癥。近年來，糖皮質激素已被用于治療ALD患者的各種臨床試驗〔6,7〕。雖然一些ALD患者的生存率有所提高，但40%的患者對皮質類固醇沒有反應。AH可導致ALD前期大量肝細胞死亡和凋亡〔8～12〕。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)抑制劑在動物實驗中已被證實能抑制肝細胞凋亡和減輕肝損傷，因此Caspase抑制劑被認為是治療ALD，特別是AH的分子靶點，但其療效尚不清楚〔13,14〕。白細胞介素(IL)-17是天然免疫系統中的一種趨化因子，通過刺激肝星狀細胞分泌IL-8和C-x-c基序趨化因子配體(CXCL1)，通過釋放肝實質中的鈣網蛋白(RO)和蛋白酶來破壞受損的肝細胞，從而招募中性粒細胞〔15〕。靶向這些趨化因子可作為AH的治療方法。酒精引起的腸道菌群變化在AH的發病機制中起著重要作用，因為酒精紊亂是一種腸道通透性，允許腸腔抗原進入肝臟并促進炎癥細胞因子的合成和分泌〔16,17〕。益生菌可以降低內毒素驅動的細胞因子水平，并改善ALD者的谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)和γ-谷氨酰轉移酶水平〔18,19〕。因此，通過益生菌改變腸道微生物區系可被視為治療ALD的潛在治療方法。

ALD患者基因表達的改變與ALD的發病密切相關。本研究擬分析ALD患者和健康對照者之間的差異表達基因。通過GO豐富和KEGG信號通路分析確定差異表達基因的功能。

1 材料和方法

1.1研究材料 從公開的基因表達綜合數據門戶(GEO，2019)獲取15個ALD組織和7個正常組織的RNA表達分析數據，登錄號為GSE28619。隨后原始數據下載后被用于進一步的分析ALD中關鍵的致病基因。

1.2微陣列數據分析 基因表達譜分析主要包括原始數據的歸一化處理和差異表達基因(DEGs)的篩選兩個步驟。原始基因矩陣數據進行歸一化處理使所有樣本之間具有可比較性，RNA轉錄本的注釋用GPL570平臺注釋信息執行〔20〕。隨后通過limmar包進行DEGs的篩選，剪切的標準為倍數>2和P值<0.05被認為是有意義。利用R軟件對數據進行可視化圖片處理。

1.3功能富集分析 在獲取差異表達mRNA后，將所有的差異性基因分別上傳到DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) 和KOBAS (version 3.0;https://bio.tools/kobas)數據庫中分別進行對DEGs的生物注釋分析和KEGG細胞信號通路分析，揭示在ALD的病理進程之中DEGs所發揮的生物學功能〔21～23〕。所有的富集結果P值<0.05被認為是有意義。

1.4蛋白互作網絡分析 STRING 是一個國際性知名的蛋白相互作用的數據庫(https://string-db.org/)。將DEGs加載到數據庫后獲取蛋白之間相互作用的網絡，隨后將該網絡在官網中進行可視化的圖片制作。

2 結 果

2.1DEGs 在各組織樣本為經過歸一化處理之前(圖1A)各數據之間不具備可比較性，但是經過歸一化處理之后所有數據的穩健多陣列平均之間具有可比較性(圖1B)。保證了數據分析符合統計學標準的基本準則。隨后通過調整P值<0.05和差異倍數>2的閾值，在ALD中共獲得216個DEGs，其中上調的DEGs 108個和108個下調DEGs(圖1C)。詳盡的DEGs將其歸納到補充表1。這些DEGs可能在ALD的病理進程中起著重要的調控作用。

圖1 在ALD中的差異性基因分析

表1 功能注釋分析結果

2.2功能富集分析 采用GO分析和KEGG分析揭示DEGs的功能。首先在DAVID 對216個DEGs進行了GO的富集分析，將最有意義的前10個結果歸納到表1。隨后在KOBAS數據庫中去完成DEGs在那些細胞信號通路中發揮調控作用，結果發現DEGs主要的富集通路在炎癥、細胞黏附、代謝相關的細胞信號通路。見表2。

表2 細胞信號通路富集結果

2.3蛋白互作網絡分析 STRING數據庫可以獲取DEGs之間的相互作用關系，將DEGs上傳到數據庫官網中。通過調整相關參數后獲取到DEGs之間的相互作用的網絡。該網絡的構建可揭示ALD病理進展中起著最為重要的調控作用的DEGs(圖2)。因此，處于網絡中核心位置的基因可能是ALD中的核心致病基因。

圖2 ALD病理進程中的DEGs之間的相互作用網絡

3 討 論

雖然一些治療方法已被應用，如一般的管理，抗TNF治療，抗氧化劑，肝移植，益生菌，趨化因子等，ALD的診斷和治療通常是在更高的并發癥和病死率的后期進行的〔24～29〕。應鼓勵早期準確診斷和制定有效的治療目標〔30〕。本研究分析了15例ALD患者和7例健康對照者的表達譜，共鑒定出216個DEGs。GO富集分析表明，這些差異表達基因主要屬于兩個功能群，即血管生成、炎癥反應、免疫反應和代謝相關的生物學過程。

肝硬化是慢性肝病的終末期結局，伴隨著肝臟的進行性纖維化，最終導致結節再生和功能喪失〔31,32〕。30%的肝硬化患者會發展為肝細胞癌(HCC)，并且HCC的風險與肝纖維化的發展同步增加。血管生成是支持腫瘤生長和直徑超過1～2 mm的擴張的必要過程，血管生成可在腫瘤形成的早期階段被誘導〔33,34〕。本研究中發現的DEGs屬于血管生成的生物學過程。除了血管生成外，許多DEGs還參與調節細胞運動和炎癥反應、免疫反應、細胞黏附、細胞對細胞因子刺激的反應，表明這些基因與ALD的進展密切相關，靶向這些基因可能有效地干擾嚴重ALD的發生〔35〕。換句話說，這些基因的差異表達表明ALD患者具有明顯的肝纖維化、肝硬化和原發性肝癌發生的風險。

許多經典的有機酸如膽汁酸參與肝臟脂質代謝。膽汁酸是兩親性洗滌劑樣分子，在肝膽固醇分解代謝的末期產生〔36〕。膽汁酸在腸內膽固醇、脂溶性維生素和膳食脂質的溶解和吸收中起著重要〔37〕。此外，膽汁酸還可以促進肝臟的膽汁流動和膽固醇分泌，并作為調節脂質、膽固醇和葡萄糖代謝的營養信號分子發揮〔38,39〕。本研究表明這些基因在脂質、膽固醇和葡萄糖的代謝中起作用，并影響ALD的進展。

本研究構建了DEGs的共表達網絡，并根據其程度值對網絡中的重要基因進行評價。重組人膜聯蛋白(ANX)A2是網絡中最重要的基因，是一種結構相關的鈣(Ca2+)-肌動蛋白和磷脂結合蛋白，在真核細胞中廣泛表達。ANXA2參與許多生物學過程，如與胞吐、內吞、有絲分裂信號和細胞骨架重排相關的膜運輸。許多研究表明ANXA2參與了腫瘤的發生。有研究探討血清ANXA2在早期肝癌診斷中的臨床應用，結果表明：ANXA2在肝癌患者和對照組之間有顯著性差異，提示血清ANXA2可作為肝癌早期診斷的生物標志物〔40〕。有研究表明ANXA2在大鼠體內的過表達促進VWF的分泌，從而減輕肝纖維化的進展，下調ANXA2可減少VWF的分泌，ANXA2的表達與肝纖維化的進展密切相關〔41〕。脂肪鈣黏蛋白(FAT)1是另一個具有高度網絡性的基因，已被證明可以調節細胞增殖、平面細胞極性和傷口愈合。FAT1在體外活化的肝星狀細胞(hscs)中高表達，下調的FAT1表達下調hscs中nf-κb活性〔42〕。這些結果表明，FAT1可能成為慢性肝病肝纖維化防治的新靶點?？傊?，所有高度表達的差異基因都與ALD的進展密切相關，尤其是肝纖維化和肝硬化。

綜上所述，對DEGs的GO富集分析表明，它們大多參與了血管生成、炎癥反應、免疫反應和代謝相關的生物學過程。本研究發現了一些新的ALD進展相關基因，為ALD的早期診斷和治療提供了新的靶點。