植物油中多環芳烴的測定及方法驗證
——高效液相色譜法（熒光檢測器）

◎ 李 超，趙雪峰，陶 燕，曹靜杰，賈松濤，郭倩倩，李夢雨，趙林萍

（河南中標檢測服務有限公司，河南 鄭州 450001）

植物脂肪是人類飲食的重要組成部分，是能量和必需脂肪酸的來源，也是脂溶性維生素的載體。油籽、植物油和脂肪制品等脂肪含量高的食物易受多環芳烴（PAHs）的污染，多環芳烴具有親脂性，因此在動植物的脂肪細胞中易于積累。植物油可能會被多環芳烴污染，如在油品加工過程使用了被污染的萃取溶劑。在一定程度上，油品的污染還可能與環境污染有關。在大氣存在多環芳烴污染的情況下，由于降水，植物在生長季節可能發生表面污染，這種污染可能會被轉移到最終產品中。許多研究人員發現，同一種油在不同生產批次中的多環芳烴含量存在顯著差異[1-2]。

世界衛生組織國際化學品安全規劃署（IPCS）、歐盟委員會糧食科學委員會以及糧農組織/世衛組織食品添加劑專家委員會分別于1998年、2002年和2005年對多環芳烴進行了評估。國際癌癥研究機構將苯并（a）芘歸為第一類致癌物，而將苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽和歸為2B類致癌物（可能對人類致癌的化合物）[3]。

近年來，植物油受到越來越多的消費者青睞，各種菜籽油、葵花籽油、大豆和橄欖油及其混合物產品出現在市場上。研究者越來越關注對多環芳烴遺傳毒性、誘變性和致癌性進行研究，為保障食品安全，需要不斷監測食品中多環芳烴的含量，以持續監測安全風險。

本文對高效液相色譜法測定多種多環芳烴的方法進行驗證，進而研究了市場上不同種類植物油中多環芳烴的污染程度，包括苯并（a）芘（BaP）、苯并（a）蒽（BaA）、苯并（b）熒蒽（BbFA）和?（CHR）等化合物含量的總和，為國家相關部門制定這些污染物質在食品中的限量值提供數據基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑和樣品

乙腈、環己烷、石油醚、甲醇，均為色譜純；氯化鈉、氫氧化鉀、無水亞硫酸鈉（分析純）；符合實驗室用水標準中的一級水；氮氣；中性氧化鋁凈化柱；多環芳烴標準混合溶液；質控樣為橄欖油CRM。

市售的30種菜籽油樣品、10種葵花籽油樣品和12種其他油樣品包括油橄欖果渣油、橄欖油菜籽油調和油、大豆油以及椰子油。菜籽油樣本包括普通精制成品油、精制初榨菜籽油和冷過濾精制初榨菜籽油，分別為國產（12個樣品）和進口（18個樣品）。分析前，樣品根據生產廠家的建議進行存儲。液體樣品于室溫放置2 h，固體樣品置于60 ℃水浴中融化。

1.2 儀器與設備

戴安UltiMate 3000高效液相色譜儀（配熒光檢測器）；PAH C18反相鍵合固定相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

2 分析步驟

2.1 樣品凈化

為了使多環芳烴萃取物的純度足夠用于色譜分析，采用氧化鋁填充玻璃柱進行純化。將氧化鋁與水的混合物（9∶1，w/w）倒入裝有多孔玻璃的玻璃柱中，在氧化鋁填料上填充無水亞硫酸鈉干燥劑。通過石油醚對凈化柱進行調節后，用10 mL石油醚稀釋0.4 g的油脂樣品，將樣品移入氧化鋁柱中，用60 mL石油醚洗脫樣品，流速為1 mL·min-1，棄去最初的20 mL石油醚，收集余下流出物。流出物經旋轉蒸發儀濃縮，氮吹除去溶劑至近干，用乙腈定容至1 mL，混勻，過0.22 μm有機相微孔濾膜，待色譜儀檢測。

2.2 高效液相色譜分析

用自動進樣器將20 μL樣品注入高效液相色譜中。柱溫保持在35 ℃，流動相為乙腈和水。梯度洗脫時間見表1，流速為1 mL·min-1。激發和發射（Ex/Em）波長：BaA和CHR為260 nm/420 nm、BbFA和BaP為290 nm/430 nm。

表1 梯度洗脫時間表

2.3 校準曲線的制備

采用外標法建立校準曲線。使用多環芳烴標準混合溶液配制標準中間工作液，濃度為10 ng·mL-1，分別吸取一定量的標準中間工作液，經稀釋后配制成濃 度 點 為0.20 ng·mL-1、0.80 ng·mL-1、4.00 ng·mL-1、8.00 ng·mL-1及10.00 ng·mL-1的系列標準溶液，以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標建立標準曲線。

2.4 樣品分析

質量控制過程包括對盲樣和作為質控樣的有證標準樣品進行檢測。

3 統計分析

3.1 測定方法的線性工作范圍

對每條多環芳烴校準曲線計算濃度限度的變異系數，然后在0.05顯著水平下使用F-Snedecor檢驗對變異系數進行檢驗，同時計算相關系數。檢出限（LOD）和定量限（LOQ）的計算公式如式（1）和式（2）所示。該方法的靈敏度以校準曲線的斜率為準。

式中：Cm-低濃度樣本中多環芳烴的平均濃度；SD-標準偏差。

3.2 統計結果分析

驗證過程中得到的結果通過Dixon Q檢驗進行識別和剔除異常值，然后對每個多環芳烴濃度計算下列統計參數，包括重現因子（正確性）、方差、標準差、變異系數、標準不確定度和擴展不確定度、重復性的置信區間和相對標準偏差。

4 結果與討論

檢出限（LOD）、定量限（LOQ）和回收率均符合國家標準《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017），在0.20～10.00 ng·mL-1濃度范圍內，各物質的校準曲線均呈良好的線性關系，相關系數均大于0.998。這些曲線用于檢驗該方法在0.80 ng·mL-1和8.00 ng·mL-1兩種濃度下的重現性和精密度。相關測定結果見表2。根據表2可以看出該方法適用于測定植物油中4種多環芳烴含量總和。

表2 方法驗證參數和評價標準表

標準混合溶液和菜籽油中多環芳烴的色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1 多環芳烴標準混合溶液色譜圖

圖2 菜籽油中多環芳烴的色譜圖

菜籽油中測定的苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽、?以及這4種多環芳烴的含量總和見表3，苯并（a）芘、苯并（a）蒽、?和苯并（b）熒蒽的回收率分別在80%～103%、87%～109%、87%～108%和91%～110%范圍內。精制菜籽油中4種多環芳烴的含量最大值為1.30～2.40 μg·kg-1，精制初榨菜籽油中4種多環芳烴的含量最大值為1.10～1.95 μg·kg-1，考慮到不確定度，含量差別并不大。冷過濾精制初榨菜籽油中苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽和的含量均低于1 μg·kg-1，4種PAHs含量之和（2.91±0.58） μg·kg-1也顯著低于精制菜籽油和精制初榨菜籽油。

表3 菜籽油樣品中多環芳烴含量表

在菜籽油中，含量占比最大的多環芳烴化合物為，其中3個菜籽油樣品中?含量超過1 μg·kg-1，4個精制初榨菜籽油樣品中其含量超過1 μg·kg-1。這一結果與ALOMIRAH等[4]的研究結果一致，其研究團隊報道在83%的植物油樣品中檢測出了?。

所有樣品中4種多環芳烴含量之和均不超過10 μg·kg-1，這 與CIECIERSKA和OBIEDZI SKI的報道一致。CIECIERSKA和OBIEDZI SKI研究發現精煉工藝在油籽加工過程中起著關鍵作用，因為其顯著降低了產品中的多環芳烴含量。菜籽油中苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽和?的污染水平，與其他國家測定的精制植物油中這些化合物的平均水平相當[5]。

在檢測的精制葵花籽油中苯并（a）芘含量不超過2.0 μg·kg-1，30%的樣品中苯并（a）芘含量低于方法驗證時測定的檢出限（0.18 μg·kg-1），50%的樣品中苯并（a）芘含量在0.18～0.25 μg·kg-1。在大多數精制葵花籽油樣品中BaP、CHR和BbFA含量均低于定量限（分別是80%、70%和80%）。多環芳烴含量最高的油品中分別含有BaP（1.86±0.28）μg·kg-1、BaA（0.92±0.14）μg·kg-1、CHR（1.42±0.21）μg·kg-1、BbFA（1.58±0.24）μg·kg-1。許多研究[1，5]表明食用油通過精制過程，特別是使用混合吸附劑（活化漂白土和活性炭），多環芳烴的含量會降低。

油橄欖果渣油和添加橄欖油的菜籽調和油樣品中多環芳烴含量均適中，苯并（a）芘最小含量低于檢出限，而最大含量分別達到0.25 μg·kg-1和0.45 μg·kg-1。油橄欖果渣油中4種多環芳烴含量總和與添加橄欖油的菜籽調和油中含量之間沒有顯著差異，具體結果見表。有研究認為，多環芳烴吸附在果實表面，在萃取過程中轉移到油脂中，油橄欖果渣油可能是多環芳烴的重要來源。多環芳烴含量可作為確定不同植物油品質和優化精制工藝的重要指標。

表4 其他種類植物油中PAHs含量表（單位：μg·kg-1）

粗制大豆油中苯并（a）芘和4種多環芳烴含量之和均顯著高于精制成品油，含量之和最高為（9.10±1.82）μg·kg-1。YE等[6]在粗制大豆油和精制大豆油中檢測到的PAHs含量明顯較低。他們認為由于油經過了中和、漂白和脫臭過程，使得苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽的含量降低。未精制的椰子油中多環芳烴的污染最為嚴重。

在本研究中，苯并（a）芘含量與4種多環芳烴含量之和呈現顯著的線性相關（r=0.947）。不同種類食用植物油樣品中，85.8%的樣品苯并（a）芘含量＜2 μg·kg-1，此外在測定的多環芳烴中，?的占比最大。

5 結論

所有被測植物油樣本中含有的苯并（a）芘及苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽、?（4種多環芳烴的總和）的含量均低于國外標準規定的限值[7]。與成品油相比，非成品油的PAHs污染水平明顯更高；未精制的椰子油中多環芳烴含量最高；精制菜籽油和精制初榨菜籽油中4種PAHs含量無顯著差異，而冷過濾精制初榨菜籽油中各PAHs的最高含量均顯著低于其他菜籽油。