HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者B、C基因型 HBV S蛋白變異比較

章曉鷹 顧超 馬道亮 張玨 高月求 孫學華

對于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因型與疾病轉歸預后的關聯，不同的研究結論存在著較大的分歧，有的研究認為病毒C基因型患者更容易轉變為肝硬化與肝癌，而有些研究則認為與基因型無關；報道提示B基因型對干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)的療效優于C 基因型，且C基因型也更容易發生多重核苷類藥物的耐藥變異[1-6]。但也有報道持不同觀點，認為不同基因型的耐藥變異無明顯區別[7-8]。

目前基因型與病毒變異關聯研究多集中于HBV P區，少有研究報道不同病毒基因型的HBV S蛋白變異差異，然而HBsAg不僅僅有B細胞表位，還含有輔助T細胞(T-helper，Th)表位與細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)表位[9-10]，均在宿主相關的免疫功能刺激中發揮重要作用[11]。但鑒于HBeAg血清學轉換過程中所產生的免疫壓力是S蛋白變異的主要原因[12]，并且，S蛋白的變異與病程和年齡有關[13]。因此，本研究重點分析比較了HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者HBV基因型的S蛋白變異差異，探討病毒基因型對疾病臨床轉歸可能的影響。

資料與方法

一、一般資料

2019年1月至2019年10月上海中醫藥大學附屬曙光醫院東院肝炎科門診或住院的HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者 99例，其中B基因型50例，C基因型49例。納入標準參照2015版《慢性乙型肝炎防治指南》[14]，所有患者均HBV DNA測序成功。HBeAg陰性慢性乙肝定義為HBeAg陰性、抗-HBe陽性，丙氨酸氨基轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)持續或反復異常，HBV DNA>2E3 IU/mL[14]。以上患者均有抗病毒藥物治療史。所有患者排除合并其他病毒感染。

二、儀器、試劑、檢測方法

1.DNA提取試劑盒為QIAmp Blood Mini Kit(QIAGEN,德國)；DNA第一次純化試劑盒為QIAGEN MinElute Purification Kit(QIAGEN，德國)；DNA第二次純化試劑盒為BigDye Xterminator Purification Kit(Applied Biosystems，美國)。之江生物乙型肝炎分型試劑盒。

2.實驗儀器：DNA測序儀(ABI 3500 Dx Genetic Analyzer，美國，Applied Biosystems)；實時熒光定量PCR儀(美國，ABI7500)

3.HBV DNA提?。喝』颊哐獫{(EDTA抗凝管)200 μL用于核酸提取，按說明書進行操作。根據Genbank HBV DNA(HBV genotype B DNA,complete genome,LC036263;HBV genotype C DNA,complete genome,AB644286)的S基因序列，利用Primer Primer 5.0設計引物，引物序列見表1。二者均涵蓋整個S蛋白。

4.PCR與S蛋白變異檢測：HBV DNA提取后分別進行PCR第一輪擴增與純化，純化后的PCR產物進行PCR第二輪擴增與純化，加入10 μL去離子甲酰胺(Hi-Di Formamide)，短時振蕩溶解DNA，95℃變性5 min，迅速置于冰上或4℃冷卻4 min，ABI 3500 Dx基因分析儀上樣測序。

第一輪PCR反應條件：5×PCR buffer 10 μL(含Tris 鹽酸 buffer，dNTP、Mg+)、Taq酶3 μL、10 μmol/L的上游引物與下游引物各1 μL(終濃度為200 nmol/L),DNA模板10 μL，補充蒸餾水25 μL至總體積為50 μL。

第一輪擴增條件：50 ℃尿嘧啶糖苷酶反應防污染 2 min；經95 ℃ 預變性15 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環；最后，72 ℃終延伸 7 min。

表1 HBV NDA S區引物序列

第二輪PCR反應條件：BigDye 2 μL、BigDye Sequencing buffer 3 μL、F或R引物0.5 μL(終濃度為250 nmol/L)，純化的DNA模板1 μL，補充蒸餾水13.5 μL至總體積為20 μL。

第二輪擴增條件：96 ℃ 預變性1 min；96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，共25個循環。

5.數據分析：利用Primer Primer 5.0將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，BLAST分析軟件進行氨基酸序列比對。

6.HBV基因分型：采用上海之江生物乙型肝炎分型試劑盒，嚴格按操作說明書進行。

三、統計學方法

利用SPSS 16.0統計軟件。計數資料以例數(百分數)表示，組間比較采用χ2檢驗；非正態分布計量資料以M(P25,P75)表示，兩組間比較采用非參數Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型患者一般資料

HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型患者的年齡、性別、HBV DNA載量差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型患者一般資料比較

二、HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型HBV S蛋白及各區域變異比較

HBeAg陰性慢性乙型肝炎C基因型S蛋白總體變異率高于B基因型，無論MHR還是MHR外以及MHR的”a”決定簇與MHR外的CTL+Th免疫表位、非免疫表位，C基因型變異率均高于B基因型，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型HBV S蛋白及各區域變異比較[例(%)]

三、HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型HBV S蛋白變異熱點及差異

HBeAg陰性慢性乙型肝炎組患者B、C基因型HBV S蛋白總變異點分別為56點、106點，平均每人變異1.12(56/50例)和2.16(106/49例)。

MHR與“a”決定簇熱點變異位點為T/I126/T/S/A，B基因型與C 基因型分別為3例和13例，兩基因型之間差異有統計學意義(χ2=7.699，P=0.006)。MHR外非免疫表位熱點變異位點為I68T/N，B基因型與C 基因型分別為3例和14例，兩基因型間差異有統計學意義(χ2=8.865，P=0.003)。MHR外免疫表位熱點變異位點為L21S，B基因型與C 基因型分別為6例和3例，連續校準統計學顯示這兩基因型之間差異均無統計學意義(P>0.05)。此外，MHR外非免疫表位的P203R/L位點，B基因型與C 基因型分別0例與6例，連續校準顯示兩基因型差異有統計學意義(χ2=4.544，P=0.033)。

討 論

S蛋白的aa100-169 為主要親水區(major hydrophilic region，MHR)，為B淋巴細胞表位，“a”決定簇(aa124-147)即位于此區域，而aa1-99與aa170-226被稱為MHR外，在MHR 外分別有CTL表位、Th表位與非免疫表位[10，15]。

先前研究提示，經過HBeAg至抗-HBe血清學轉換，MHR外變異率明顯升高，并在HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者達到峰值，認為S蛋白變異尤其是MHR外變異不僅為免疫壓力所致的后果，可能也是乙型肝炎復發的原因[16]。從本次觀察數據來看，HBeAg陰性慢性乙型肝炎C基因型患者S蛋白總體變異率明顯高于B基因型，且無論是MHR還是MHR外，以及MHR外的免疫表位與非免疫表位，或MHR內的“a”決定簇，B與C基因型之間的變異差異均有統計學意義，提示C基因型更容易產生S蛋白變異，增加的變異位點為隨機性分布，因此，兩基因型之間的變異差異在S蛋白的各個區域相當。

由于C基因型不僅僅在B淋巴細胞表位，在CTL+Th免疫表位還有非免疫表位均出現變異增加，從理論而言MHR變異直接影響HBsAg抗原性，導致與抗體結合能力下降，這與疫苗等免疫逃逸有關，并可使體液免疫功能下降[9]；同樣MHR外區域由于含有CTL表位與Th表位，其變異也可影響患者的細胞免疫功能[10]。有研究提示S蛋白變異可通過誘導表面抗原合成的不平衡并使其在胞漿內質網中停留，從而引起內質網應急反應，這可能與肝臟疾病的嚴重性有關[17,18]。因此推測細胞免疫與體液免疫功能的影響或者內質網應急的產生等可能是不同基因型與疾病進展預后關聯的原因。

MHR 熱點變異位點為I/T126T/S/，此位點被稱之為“免疫逃逸”位點[9]，通常B基因型為蘇氨酸，C基因型為異亮氨酸。有研究稱，大部分C基因型患者為異亮氨酸，約有10%為蘇氨酸，但從異亮氨酸轉變為蘇氨酸時伴隨著胸腺嘧啶(ATT)轉變為胞嘧啶(ACT)，這可以導致HBsAg 抗原性改變[12]。本研究結果顯示，該位點C基因型變異均高于B基因型，但此變異究竟是不是屬于亞型變異，以及此位點變異是否影響了HBsAg 抗原性，可能還要進一步觀察。除此之外，MHR外非免疫表位與免疫表位熱點變異位點分別為I68T/N與L21S，I68T/N在B、C基因型之間差異均有統計學意義，C基因型高于B基因型，而L21S則兩基因型之間無任何差異。但是，I68T/N變異及其變異的臨床意義尚未見報道，因此，本觀察僅能提示C基因型更容易出現I68T/N位點變異。有研究報道，有兩個C端區位點P203Q與S210R與肝癌顯著相關[18]，但此次觀察中，HBeAg陰性慢性乙型肝炎基因型之間P203R/L變異差異有統計學意義，C基因型高于B基因型，而S210R/I則未顯示該位點變異與基因型有關。

另外，由于S蛋白與P區的反轉錄酶區(RT區)重疊，兩者之間變異可互為影響，但是，可產生核苷類藥物耐藥的變異位點多見于rtM204I/sW196*,rtA181T/sW172* 與rtV191I/sW182*這3個P與S區相關聯位點[19]。本實驗僅在HBeAg陰性慢性乙型肝炎C基因型患者中檢測出3例rtM204I/sW196*變異位點，患者均有拉米夫啶治療史，但無法確定S區與P區誰先變異。

總之，HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者C基因型較B 基因型更容易產生S 蛋白變異，并可能由此通過HBsAg免疫原性改變、或通過影響細胞免疫與體液免疫功能的或通過內質網應急等機制左右疾病的預后轉歸。