馬錢子堿誘導(dǎo)人葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡影響及作用機(jī)制研究

史雪麗，陳婷，蘇勝，張麗娟

葡萄膜黑色素瘤多發(fā)于40～60 歲，是成人最常見的眼內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤。葡萄膜黑色素瘤起源于葡萄膜黑色素細(xì)胞，85%發(fā)生在脈絡(luò)膜，多單側(cè)發(fā)病，惡性度較高[1-2]。手術(shù)可以有效清除病灶，但是，對(duì)于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或失去手術(shù)時(shí)機(jī)的晚期腫瘤患者，生物治療可以有效控制腫瘤擴(kuò)散，因此，尋找一種療效好、副作用小、安全性高的治療藥物迫在眉睫。馬錢子堿（brucine）為中藥馬錢子的主要生物堿單體，具有抑制免疫、殺菌消毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等藥理作用[3-4]。本研究擬在細(xì)胞水平進(jìn)一步研究馬錢子堿對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥物

人眼葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞UM90（美國ATCC公司），馬錢子堿（美國Sigma 公司），二甲基亞砜、胎牛血清（杭州四季青公司），CCK-8 細(xì)胞增殖檢測試劑盒（南京建成生物研究所），蘇木精-伊紅（hematoxylin-Eosin staining，HE）染色液（北京索萊寶科技有限公司），Hoechst 33258 染色試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），Annexin-V/PI 試劑盒（美國BD公司），BCA 蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物科技公司），PVDF 膜及化學(xué)發(fā)光試劑（南京建成生物研究所），Bax 及Bcl-2 抗體（北京中杉金橋公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

黑色素瘤細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的1 640培養(yǎng)基（鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 U/mL）中，培養(yǎng)箱CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，溫度為37℃，每3 d 更換一次新鮮培養(yǎng)液。

1.3 黑色素瘤細(xì)胞分組

共分成4 組。（1）對(duì)照組（CG）：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。（2）馬錢子堿組：依馬錢子堿濃度不同分為3 個(gè)亞組。馬錢子堿低濃度組（brucine low concentration group，BLG），馬錢子堿中濃度組（brucine medium concentration group，BMG），馬錢子堿高濃度組（brucine high concentration group，BHG）即在培養(yǎng)基中依次加入25、50、100 μg/mL 的馬錢子培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 黑色素瘤細(xì)胞增殖能力檢測

細(xì)胞接種于96 孔板中，細(xì)胞密度為1×105/mL，100 μL/孔，按照上述分組方法孵育24 h 后將培養(yǎng)液吸出，PBS 輕輕沖洗3 次，每孔分別加入20 μL 已配置含的10%CCK-8 溶液，37℃恒溫箱中孵育1 h 后測定各孔450 nm 的吸光值。

1.5 HE 染色觀察馬錢子堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

上述分組后的細(xì)胞培養(yǎng)于載玻片上，95%乙醇固定細(xì)胞，蘇木素染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，梯度酒精脫水后晾干，中性樹膠封片。

1.6 Hoechst 33258 染色法觀察細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL，加入Hoechst 33258 染液混勻后室溫避光孵育10 min，PBS 沖洗2 次后用波長為352 nm 的氪激光激發(fā)，倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.7 Annexin V/PI 檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞培養(yǎng)于6 孔板中，每孔500 μL，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，磷酸緩沖液沖洗3 次，離心（1000 r/min）后重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL，黑暗中在室溫下分別加入5 μL Annexin-V 和10 μLPI 染液，15 min 后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 Western blot 法檢測黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)Bax 及Bcl-2 的蛋白表達(dá)

提取蛋白質(zhì)后以聚丙烯酰胺凝膠電泳，5%的脫脂奶粉溶液4℃封閉2 h，加一抗（稀釋濃度1：1000）過夜，洗膜后室溫下孵育二抗（稀釋濃度1：2000）1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光法自顯影并采集圖像，統(tǒng)計(jì)分析Bax及Bcl-2 的蛋白的相對(duì)表達(dá)率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組組間比較采用LSD-t 法，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑色素瘤細(xì)胞增殖率比較

4 組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝23.450，P＝0.000）。與CG 組比較，BLG 組、BMG 組及BHG 組細(xì)胞增殖率均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tBLG＝7.964，PBLG＝0.000；tBMG＝12.920，PBMG＝0.000；tBHG＝20.962，PBHG＝0.000）。與BLG 組比較，BMG 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），BHG 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.720，P＝0.000）。與BMG 組比較，BHG 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝6.291，P＝0.000）（表1）。

表1 馬錢子堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖率的影響（，n＝5）

表1 馬錢子堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖率的影響（，n＝5）

注：* 與對(duì)照組比較，P＜0.05；# 與BLG 組比較；P＜0.05；&與BMG 組比較，P＜0.05。CG 對(duì)照組；BLG 馬錢子堿低濃度組；BMG 馬錢子堿中濃度組；BHG 馬錢子堿高濃度組

2.2 馬錢子堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

正常細(xì)胞的胞核被蘇木精染成藍(lán)色，細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色，馬錢子堿作用于黑色素瘤細(xì)胞后，細(xì)胞密度減少，細(xì)胞間隙增大，馬錢子堿中、高濃度組細(xì)胞核體積縮小明顯（圖1）。

圖1 HE 染色觀察馬錢子堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞形態(tài)的影響（HE×400）。1A 對(duì)照組（CG）；1B 馬錢子堿低濃度組（BLG）；1C 馬錢子堿中濃度組（BMG）；1D 馬錢子堿高濃度組（BHG）

2.3 黑色素瘤細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

Hoechst 33258 染色劑可以進(jìn)入凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下，表現(xiàn)為致密顆粒狀強(qiáng)熒光集聚（亮藍(lán)色高熒光），以100 μg/mL 的馬錢子堿組最為明顯（圖2）。

圖2 黑色素瘤細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察（HE×200）。2A 對(duì)照組（CG）；2B 馬錢子堿低濃度組（BLG）；2C 馬錢子堿中濃度組（BMG）；2D 馬錢子堿高濃度組（BHG）

2.4 黑色素瘤細(xì)胞凋亡率比較

4 組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝9.550，P＝0.000）。與CG 組比較，BLG 組、BMG 組及BHG 組細(xì)胞凋亡率逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tBLG＝7.982，PBLG＝0.000；tBMG＝12.744，PBMG＝0.000；tBHG＝15.960，PBHG＝0.000）。與BLG 組比較，BMG 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），BHG 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝6.940，P＝0.000）。與BMG 組比較，BHG 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖3、表2）

圖3 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)簡單凋亡。3A 對(duì)照組（CG）；3B 馬錢子堿低濃度組（BLG）；3C 馬錢子堿中濃度組（BMG）；3D 馬錢子堿高濃度組（BHG）

表2 馬錢子堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡率的影響（，n＝5）

表2 馬錢子堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡率的影響（，n＝5）

注：* 與對(duì)照組比較，P＜0.05；# 與BLG 組比較；P＜0.05；&與BMG 組比較。CG 對(duì)照組；BLG 馬錢子堿低濃度組；BMG 馬錢子堿中濃度組；BHG 馬錢子堿高濃度組

2.5 Bax 及Bcl-2 蛋白表達(dá)比較

Bax：4 組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝7.660，P＝0.000）。與CG 組比較，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tBLG＝4.082，PBLG＝0.004；tBMG＝16.740，PBMG＝0.000；tBHG＝28.990，PBHG＝0.000）。與BLG 組比較，BMG 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.660,P=0.000），BHG 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝23.680，P＝0.000）。與BMG 組比較，BHG組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝11.020，P＝0.000）（表3）。

Bcl-2：4 組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝11.210，P＝0.000）。與CG 組比較，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tBLG＝6.678，PBLG＝0.000；tBMG＝9.080，PBMG＝0.000；tBHG＝10.079，PBHG＝0.000）。與BLG 組比較，BMG 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.340,P=0.000），BHG 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝14.550，P＝0.000）。與BMG 組比較，BHG組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.674，P＝0.006）（表3）。

表3 各組Bax 及Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)比較（，n＝5）

表3 各組Bax 及Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)比較（，n＝5）

注：* 與對(duì)照組比較，P＜0.05；# 與BLG 組比較，P＜0.05。CG 對(duì)照組；BLG 馬錢子堿低濃度組；BMG 馬錢子堿中濃度組；BHG 馬錢子堿高濃度組

3 討論

葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞惡性度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療方法為手術(shù)與放療、化療結(jié)合，因?yàn)楹谏亓鼍哂泻芨叩霓D(zhuǎn)移能力和侵襲性，手術(shù)和放療很難避免病灶復(fù)發(fā)[5]。化療藥物通過血液循環(huán)到達(dá)全身各個(gè)組織，殺滅可能存在的微小轉(zhuǎn)移灶，因此，化療及靶向治療在葡萄膜黑色素瘤的治療中，逐漸發(fā)揮重要作用[6-7]。但是，化療藥物主要通過肝臟及腎臟代謝排出體外，傳統(tǒng)化療藥物在發(fā)揮抗癌作用的同時(shí)，會(huì)將正常的細(xì)胞一并損害[8]。此外，化療藥物還存在降低免疫力、抑制造血功能、消化道不良反應(yīng)等副作用，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。

腫瘤細(xì)胞具有持續(xù)自我更新能力，通過無限增殖破壞正常的細(xì)胞組織，并抵抗化療和放療，這也是腫瘤疾病容易復(fù)發(fā)的原因[9]。中藥在提高患者免疫能力的同時(shí)，也能減輕放化療的副反應(yīng)，其生物學(xué)療效肯定。馬錢子堿提取自馬錢科植物的種子，是一種吲哚性生物堿，具有天然、低毒、高效、價(jià)格低廉的特征[3-4,10]。本研究中，CCK-8 結(jié)果顯示，馬錢子堿呈濃度依賴性抑制了黑色素瘤細(xì)胞的生長，說明該藥物具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。判斷細(xì)胞凋亡最直觀方法為細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，本研究分別采用了HE染色法及Hoechst 33258 核染色法觀察細(xì)胞形態(tài)。HE 染色結(jié)果顯示，馬錢子堿作用于黑色素瘤細(xì)胞后，細(xì)胞密度減少，細(xì)胞間隙增大，其中，馬錢子堿中、高濃度組細(xì)胞核體積縮小明顯。Hoechst 33258核染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞核未出現(xiàn)高熒光，馬錢子堿處理后的黑色素瘤細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮的亮藍(lán)色高熒光團(tuán)塊（細(xì)胞凋亡后出現(xiàn)了核固縮），上述兩種形態(tài)學(xué)染色方法觀察結(jié)果一致，有力的證明了馬錢子堿具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。流式細(xì)胞技術(shù)是利用流式細(xì)胞儀在細(xì)胞分子水平上對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行定量分析的一種分選技術(shù)，馬錢子堿處理后的黑色素瘤細(xì)胞凋亡比例明顯下降，檢測結(jié)果從另一個(gè)角度認(rèn)證了馬錢子堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

機(jī)體組織通過凋亡反應(yīng)清除異常細(xì)胞，既保證了生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，又促進(jìn)了系統(tǒng)發(fā)育[11-12]。多種因素（衰老、藥物、氧化損傷、射線）能夠誘發(fā)凋亡反應(yīng)，當(dāng)機(jī)體正常的凋亡過程受到破壞或凋亡過程紊亂時(shí)，引發(fā)多種疾病，例如自身免疫性疾病及腫瘤[13]。Bcl-2 家族是線粒體凋亡途徑中的重要調(diào)節(jié)因素[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿誘導(dǎo)了黑色素瘤細(xì)胞Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)。

總之，馬錢子堿通過調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白及Bcl-2 蛋白表達(dá)抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，馬錢子堿有望成為治療葡萄膜黑色素瘤的潛在性藥物。