高內涵成像分析系統原理及其在藥物篩選中的應用

唐梅 于曉鳳

【摘要】高內涵成像分析系統目前已成為藥物篩選、細胞生物學功能研究的常用技術，廣泛應用至腫瘤、干細胞、炎癥、靶點驗證、免疫性疾病和新藥研發等研究領域。文章簡要概述了高內涵系統的原理，并對其在細胞周期、凋亡、細胞毒性、細胞遷移等方面的研究進展作一綜述。

【關鍵詞】高內涵成像分析系統;藥物篩選;應用

Abstract： High content imaging analysis system （HCA） has become the common technology in drug screening and cell biology function research， which has been widely used in the field of tumors， stem cells， inflammatory， autoimmune disease， target validation， autoimmune disease and drug development. This paper summarizes the principle of the HCA， as well as the research developments in the research of cell cycle， apoptosis， cell toxicity， migration.

Key words： high content imaging analysis system; drug screening; application

【中圖分類號】F763 ? 【文獻標識碼】A ? 【文章編號】2026-5328（2021）06-041-03

0引言

細胞成像技術已成為細胞生物學、腫瘤生物學等許多相關研究領域的常用技術，成像技術可以將由簡至繁的疾病、細胞、生物和化學事件可視化，觀察簡單、快速。但無法進行單細胞水平的批量參數分析。作為細胞生物學功能研究的另一種常用技術，流式細胞分析技術（flow cytometry， FCM）可以對熒光標記的單細胞或顆粒進行定量分析，具有高速、精準等優點，但無法同時獲得圖像，會丟失細胞形態、結構、動態變化、3D結構等信息。

高內涵成像分析系統（High Content Analysis， HCA）可以結合細胞成像技術和流式細胞技術的優點，進行全自動高通量熒光顯微成像及多參數定量圖像分析，為科研提供了快速有效的工具，目前已應用至腫瘤、干細胞、炎癥、免疫性疾病、靶點驗證和新藥研發等研究領域，成為細胞生物學功能研究的常用技術[1-5]。HCA圖像分析軟件具有智能化參數處理模塊，采用以細胞數據庫為基礎的計算模型，大大提高了對復雜圖像的批量分析能力。文章概述了高內涵細胞成像系統的技術原理，并根據我們的實驗經驗對影響實驗結果的因素進行總結和討論，最后對其在細胞周期、細胞毒性、細胞遷移等方面的應用進展作一綜述。

1 ?HCA的技術原理

1.1 HCA的概念。

高內涵系統也被稱為高內涵篩選，其概念早在20世紀80年代就被提出[6]，早期應用于藥物發現領域，現在已廣泛應用于腫瘤學、免疫學、毒理學、藥學、神經生物學等多個領域[7-12]。HCA能夠在保持細胞結構和功能完整的前提下，對細胞、亞細胞及3D微組織進行多通道的自動化成像，獲得單細胞水平的細胞形態、熒光強度、細胞動態等多維參數[13-15]。

1.2 HCA的實驗流程。

HCA的實驗流程包括高內涵成像樣品的準備、獲取明場或熒光圖像、高內涵數據分析。（1）樣品準備

樣品準備包括微孔板選擇和細胞培養和熒光標記。高內涵的成像孔板包括6-384孔板，貼壁細胞的培養適合選擇TC-treated孔板，保證細胞貼壁良好，普通多孔板厚度約為 1um，適合于低倍鏡拍攝。分析細胞濃度、形態時可以選擇普通多孔板，但在觀察細胞器結構等需要更好成像效果的實驗以及需要使用高倍鏡如40倍、63倍鏡時，都適合選擇薄底板。微孔板常用有聚苯乙烯材質和玻璃材質，玻璃材質相對透光性更好，但不合適貼壁細胞的培養，可以對微孔板進行特殊處理，如用明膠、膠原等包被[16，17]。細胞需均勻單層鋪板，鋪板時優化細胞濃度，控制細胞生長時間，保證檢測時細胞密度不超過75%，以確保分析時細胞拆分準確。細胞處理和熒光標記時需參考文獻確定藥物濃度、處理時間、抗體染料濃度等。

（2）圖像獲取

隨著高內涵系統和顯微鏡領域的發展，HCA設備在光源、采集裝置等配置上都有了很大提高。HCA具有寬場、明場、共聚焦三種成像方式，寬場成像視野大、速度快，但存在較大的背景噪聲，且成像深度不夠。共聚焦成像可以去除非焦平面的信號，使得其對比度和分辨率更高，但共聚焦成像需要更長的曝光時間或能量更強的激發光，造成對細胞的光毒性和光淬滅性更大。所以對于易淬滅熒光樣品及活細胞長時間動態觀察的實驗，合適選擇寬場成像，對于厚樣本和微組織3D成像適合選擇共聚焦成像模式。

（3）數據分析

HCA的分析軟件可對同一實驗的多參數、多維度數據進行自動化定量分析，包括對細胞個體或群體進行靶標分子定量檢測和表型檢測，以及進行大數據生物信息學分析。分析系統預設幾十種復雜而精確的算法對圖像進行運算獲得數百種圖像參數，從而挖掘生物學相關信息。目前常用的分析軟件有PerkinElmer公司的Columbus、Operetta、High content profiler以及Thermo Fisher公司的HCS Studio細胞分析軟件、Store圖像及數據庫管理軟件等。

2 ?HCA在藥物篩選領域的應用

2.1 細胞周期

腫瘤治療中最重要的治療策略之一就是針對細胞增殖與細胞分裂進行抑制。這兩者都可以使用高內涵多標記細胞成像方式檢測[18]。崔巍等[19]采用應用高內涵技術對心肌成纖維細胞增殖和細胞周期進行分析，檢測了 BrdU陽性比例細胞各分裂時期細胞百分比，將各項參數與流式細胞分析結果對比發現沒有統計學差異，證明了高內涵系統能精確、量化地分析細胞增殖。段紹維等[20]利用高內涵系統獲得有絲分裂指數、微管、紡錘體形成等細胞周期評價指標，分析了土槿皮乙酸對人乳腺癌細胞周期的影響。Gasparri等[21]利用高內涵系統分析了BrdU陽性的細胞比例、細胞核熒光強度等增殖參數，研究生長因子和血清刺激后人皮膚成纖維的增殖情況。

2.2 細胞凋亡

細胞凋亡是一個與基因的激活、表達、調控等復雜作用相關的過程，所以對于凋亡的檢測評價參數應是多維度的。目前對于凋亡的研究主要在形態學和生物化學水平上的變化，形態學變化包括核皺縮、核膜破碎、線粒體形態變化、凋亡小體出現等。生物化學上的變化包括染色質的DNA斷裂、線粒體膜電位變化、胞膜滲透性變化、caspases （半胱天冬酶）的激活等。喬可等[22]應用高內涵的活細胞長時間成像模塊通過檢測細胞數、細胞核的熒光強度、細胞核尺寸、細胞核的碎片化等多種參數，研究了小鼠神經瘤母細胞經谷氨酸處理后的形態學變化特征。任艷青等[23]利用高內涵系統通過檢測線粒體膜電位、膜通透性、核DNA 含量、核形態、細胞數量等參數的變化研究了黃芩配方顆粒對人肝癌 HepG2細胞凋亡的影響。

2.3 細胞毒性

在藥物研發過程中，能夠及時對早期毒性指標進行檢測是非常重要的一部分。李丹丹等[24]用生首烏醇提物和制首烏醇提物處理人源性肝癌細胞Hep G2，利用高內涵系統獲得細胞數、胞內轉錄調控因子、線粒體功能相關參數等檢測指標，證明兩種藥物的肝毒性與細胞凋亡具有很大的相關性。利用高內涵的活細胞長時間成像模式監測藥物細胞毒性的研究也很多。高陽[25]等利用高內涵系統動態觀察藥物處理后的Hep G2細胞數、核DNA含量、谷胱甘肽水平、活性氧水平、線粒體膜電位等5個參數，對藥物的細胞毒性作用進行定量分析。

2.4細胞遷移

腫瘤轉移是惡性腫瘤重要的生物學特性，研究腫瘤轉移過程及分子機制對于臨床治療有重要意義。研究者開始利用高內涵系統對單細胞進行長時間實時追蹤，分析細胞運動的距離、速度、偏轉角度等遷移參數。王睿[26]采用transwell實驗利用高內涵系統長時間動態檢測2種黃酮類化合物處理后胃癌細胞的遷移情況，研究發現兩種化合物均能抑制胃癌細胞的遷移能力。近年來對于miRNA在腫瘤治療中的研究越來越多，研究表明miRNA在腫瘤細胞增殖、遷移等過程中起到重要調控作用，對于腫瘤治療具有重要意義。常顏信[27]利用高內涵系統篩選出17個與膽囊癌轉移相關的miRNAs。Zhang H S[28]等對癌細胞中參與調控細胞遷移的miRNAs利用高內涵系統進行檢測，發現在各種不同類型的癌細胞中超過20%的miRNAs對細胞的遷移能力產生影響。

3 ?結語

近年來，高內涵系統因其高通量、高效率等優勢已在腫瘤研究、新藥研發等方面得到廣泛應用。高內涵系統可以在一次實驗中獲得多靶點、多維度且同時涉及形態學和生物化學水平的參數，其配置的活細胞工作站模塊可以對細胞的生長、遷移等活動進行長時間動態監測，復雜、智能的自動化分析軟件為研究者提供精確、可靠的數據。因此，高內涵技術已成為藥物篩選和細胞生物學領域的重要技術手段。

【參考文獻】

[1]LINZ S， SCHORPPZ K， ROTHENAIGNER I， et al. Image-based high-content screening in drug discovery [J]. Drug Discovery Today， 2021， 25（8）：1348-1361

[2]SOMMER C， HOEFLER R， SAMWER M， et al. A deep learning and novelty detection framework for rapid phenotyping in high-content screening[J]. Molecular Biology of the Cell， 2017， 28（23） ： 3428.

[3]CHAMBERS K M， MANDAVILLI B S， DOLMAN N J， et al. General staining and segmentation procedures for high content imaging and analysis[M].Methods in Molecular Biology， 2018， 1683： 21-31.

[4]JOY M E， VOLLMER L L，HULKOWER K， et al. A high-content， multiplexed screen in human breast cancer cells identifies profilin-1 inducers with anti-migratory activities. [J]. PLoS ONE， 2017， 9（2）： e88350

[5]KICHEOL H， DAECHAN P， SHINYEONG J， et al. Streamlined selection of cancer antigens for vaccine development through integrative multi-omics and high-content cell imaging[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）：5885.

[6]GIULIANO KA，DEBIASIO RL，DUNLAY RT，et al. High-content screening： a new ? approach to easing key bottlenecks in the drug discovery process [J]. J Biomol Screen，1997，2：249-259

[7]GUO J Y， WANG P Z， SOZEN B， et al. Machine learning-assisted high-content analysis of pluripotent stem cell-derived embryos in vitro [J]. Stem Cell Reports， 2021， DOI： 10.1016/J.STEMCR.2021.03.018.

[8]DARKO S， GEORGE T， KOLJA W， et al. Prostate cancer diagnosis using epigenetic biomarkers， 3D high-content imaging and probabilistic cell-by-cell classifiers [J]. Oncotarget， 2017， 8（34）： 57278-57301.

[9]ALEXANDER G F， YASUHIRO I， OKSANA S， et al. High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes [J]. ASSAY and Drug Development Technologies， 2015， 13（9）：529-546.

[10]CARLSSON A， KUHN P， LUTTGEN M S， et al. Paired High-Content Analysis of Prostate Cancer Cells in Bone Marrow and Blood Characterizes Increased Androgen Receptor Expression in Tumor Cell Clusters[J]. Clinical Cancer Research， 2017， 23（7）：172-1732.

[11]THORNE N， MALIK N， SHAH S， et al. High-throughput phenotypic screening of human astrocytes to identify compounds that protect against oxidative stress [J]. Stem Cells Transl Med， 2016， 5（5）： 613-627.

[12]CARTER C A. Multiplexed high content screening reveals that cigarette smoke condensate-altered cell signaling pathway are accentuated through FAK inhibition in human bronchial cells [J] . International Journal of Toxicology， 2012， 31（3）： 257-266.

[13]SINGH S，CARPENTER A E，GENOVESIO A. Increasing the content of high-content screening： An overview [J]. Journal of Biomolecular Screening， 2014， 19（5）：640-650

[14]陳凱先，蔣華良，羅小民，等.后基因組時代的藥物發現：趨勢和實踐[J].中國天然藥物， 2004， 2（5）：257-260

[15]GIULIANO K A，HASKINS J R，TAYLOR D L. Advances in high content screening for drug discovery [J]. Assay Drug Dev Technol， 2003， 1（4）：565-577

[16]VOZZI G，LENZI T，MONTEMURRO F，et al. A novel method to produce immobilised biomolecular concentration gradients to study cell activities： design and modelling [J]. Mol Biotechnol， 2012， 50（2）：：99-107

[17]SUN Y，HUANG Z，YANG K ，et al. Surface coating as a key parameter in engineering neuronal network structures in vitro [J]. Biointerphases， 2012， 7（1-4）：29

[18]GASPARRI F，CAPELLA P，GALVANI A. Multiparametric cell cycle analysis by automated microscopy [J]. Journal of Biomolecular Screening， 2006， 11（6）：586

[19]崔巍，李玉琳，吳依娜，等.高內涵篩選與流式細胞分析技術在心肌成纖維細胞增殖研究中的應用[J].生理學報， 2014， 66（2）：215-222

[20]段紹維，徐波，陳云利，等.高內涵法探討土槿皮乙酸對MCF-7 細胞抑制作用的機制[J].生物化學與生物物理進展， 2010， 37（12）：1313-1322

[21]GASPARRI F， MARIANI M， SOLA F， et al. Quantification of the proliferation index of human dermal fibroblast cultures with the ArrayScan high-content screening reader [J]. Drug Discovery Today， 2004， Suppl（3）：31

[22]喬可，崔士超，胡捷先，等.高內涵篩選結合活細胞實時成像技術分析谷氨酸誘導的小鼠神經瘤母細胞N2a凋亡[J].復旦學報， 2015， 42（4）：538-542

[23]任艷青，田宇柔，牛麗穎，等.黃芩配方顆粒調控 HepG2 細胞增殖與凋亡的機制[J].北京中醫藥大學學報， 2016， 10（39）：844-849

[24]李丹丹，湯響，林龍隆，等.基于高內涵篩選技術研究生首烏和制首烏醇提物的肝毒性機制[J].中國藥理學與毒理學雜志， 2017， 31（6）：1000-3002

[25]高陽，胡宇馳，左澤平.應用高內涵分析技術進行藥物肝毒性風險評估的研究[J].藥學研究， 2015， 12：688-691

[26]王睿.Genistein及其改構體KBU2046對胃癌細胞的轉移抑制作用及機制研究[D].第四軍醫大學， 2014

[27]常顏信. 膽囊癌轉移相關miRNAs的高內涵篩選及功能和機制研究[D].第二軍醫大學，2013

[28]ZHANG H S，HAO Y，YANG J Y，et al. Genome-wide functional screening of miR-23b as a pleiotropic modulator suppressing cancer metastasis [J]. Nature Communications， 2011 ， 2（1）：554

基金項目：浙江中醫藥大學科研項目資助（批準號：2020ZY19）

作者簡介：唐梅，1987.08，女，漢族，安徽合肥人，碩士，助理實驗師，研究方向：細胞與分子生物學。

*通訊作者：于曉鳳，1989.11，女，漢族，山東萊西人，碩士，助理實驗師，研究方向：細胞與分子生物學。

浙江中醫藥大學中醫藥科學院 ?杭州 ?310053