對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷的分子機制

王帆 朱哿瑞 劉成海 陶艷艷

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)是目前最常見以及最嚴重的藥物不良反應之一，重者可致肝衰竭甚至是死亡；據世界衛生組織統計，每100 000病人至少有10～15例DILI[1]。作為臨床常用藥物，對乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)仍是許多國家引起DILI和急性肝衰竭的常見原因[2]。通常APAP誘導的氧化應激和線粒體功能障礙在DILI的發病機制中起著核心作用[3]，近年來，APAP肝毒性有了更深入的研究，涉及APAP和/或其代謝產物導致絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)激活、線粒體膜通透性轉變(mitochondrial membrane permeability transition,MPT)、Keap1-Nrf2-ARE激活等多種信號分子傳導途徑，本文旨在綜述APAP肝損傷的分子機制，為其臨床治療拓展思路。

一、APAP在肝臟中的代謝

通常情況下，治療劑量的APAP進入肝臟后，大部分(約90%)的APAP在II相代謝反應結合酶的作用下轉化成無毒的化合物，并通過腎臟與尿液一同排出體外，參與此反應的結合酶主要是UDP-葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronyltransferase,UGTs)和磺酸轉移酶(sulfotransferase,SULTs)。剩余的APAP(約有10%)被細胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)代謝，從而形成反應性代謝產物N-乙酰基-P-苯醌亞胺(NAPQI)，高反應性的NAPQI可快速與肝谷胱甘肽(Glutathione,GSH)結合并排入膽汁[4]。但當APAP達到毒性劑量時，過量的APAP將會導致II期代謝葡萄糖醛酸或硫酸化途徑飽和，從而使大量的APAP進入到CYP途徑中，繼而增加了NAPQI的產生[5]。NAPQI的聚集會進一步導致還原型谷胱甘肽(GSH)的嚴重耗竭；在GSH耗盡后，過量的NAPQI將與替代目標(如蛋白質、DNA、不飽和脂質等)反應并產生一系列反應，如氧化應激、脂質過氧化等，最終導致肝細胞的死亡。同時，作為一種抗氧化酶，GSH的降低會加重肝細胞的氧化應激。氧化應激可形成大量的副產物ROS，通過改變DNA、脂質、蛋白質等大分子引起肝細胞的損傷。

總的來說，無論是NAPQI與蛋白質結合所形成的APAP蛋白質加合物(APAP Protein Adducts)，抑或是GSH的耗竭都會引起氧化應激并最終發揮細胞毒作用。目前發現與氧化應激相關的分子通路主要有JNK/ASK-1[6]以及Nrf2[7]、TRPM2激活，且針對上述幾種信號通路的抑制劑均可保護APAP肝損傷。另外，線粒體通透性改變(mitochondrial permeability transition,MPT)在APAP誘導的肝細胞損傷以及壞死中也有著不可忽略的作用，MPT已經被證明是APAP毒性機制中的重要一環[8]。

UGTs:葡萄糖醛酸轉移酶；SULTs:磺酸轉移酶；CYP450:細胞色素P450酶；GSH:谷胱甘肽；NAPQI:N-乙酰基-P-苯醌亞胺；APAP-AD:APAP蛋白質加合物圖1 APAP在肝臟中的代謝

二、JNK信號通路激活

JNK(c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶)又稱為應激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)，屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族。JNK亞型——JNK1、JNK2、JNK3蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要存在于細胞質中[9]，多種信號如紫外線照射、毒性劑等均可激活JNK信號通路，且JNK持續激活會促進細胞的損傷以及死亡。

毒性劑量APAP作用下，JNK信號通路的激活主要與氧化應激產生的ROS相關。其中，早期(1～2 h)階段由糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)以及下游混合譜系激酶3(mixed-lineage kinase-3，MLK3)參與激活。有研究表明，在APAP誘導小鼠肝損傷的早期，使用反義寡核苷酸沉默GSK-3β，可以起到保護APAP肝損傷的作用[10]。晚期(2～4 h)階段則受到肝臟中凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal-regulating kinase-1,ASK-1)的調節，ASK-1為MAPK激酶激酶(MAPK kinase kinases,MAPKKKs)[11]，其激活對JNK信號通路磷酸化起著主要作用。ASK-1與GSK-3β均可使MKK4/7磷酸化，從而激活JNK信號通路[12]。JNK信號通路激活后易位至線粒體并與Sab蛋白結合。研究表明，當Sab與JNK結合時，其位于線粒體外膜內側的非受體型6 蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP1)將會被磷酸化生成 p-SHP1并轉移至線粒體內膜，進而通過內膜對接蛋白使 p-Src去磷酸化失活并形成具有破壞電子傳遞作用的Src，在線粒體呼吸鏈的作用下加劇氧化應激ROS的產生[13]，從而進一步維持JNK活性，誘導線粒體膜通透性改變，從而導致線粒體腫脹壞死[12]。

目前最常用的JNK抑制劑為SP600125，當SP600125的濃度為20 μmol/L時可以有效保護APAP致原代肝細胞壞死[14]。Saito等[15]發現，SP600125可在促進肝臟GSH(還原型谷胱甘肽)恢復的同時降低肝臟線粒體GSSG(氧化型谷胱甘肽)水平，從而證明了SP600125對肝細胞的保護作用主要由于其對線粒體氧化應激抑制。來氟米特(Leflunomide,LEF)是臨床常用的抗風濕類藥物，同樣對肝細胞具有保護APAP肝損傷作用。有研究表明，來氟米特可抑制JNK1、JNK2磷酸化，阻止線粒體通透性的改變及促細胞凋亡因子的釋放，從而保護肝細胞損傷[16]。

三、Keap1-Nrf2-ARE信號激活

當氧化應激產生自由基時，機體中維持細胞氧化還原平衡的抗氧化防御系統會被激活。常見的抗氧化信號通路——Keap1-Nrf2-ARE通路，由Kelch樣ECH相關蛋白1(Keap1)、核因子類紅細胞2-相關因子2(Nrf2)以及抗氧化反應元件(ARE)組成[17]。Nrf2是一種可與抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)結合的轉錄因子，屬于CNC轉錄因子家族[18]，其抗氧化作用的激活與Keap1相關。ARE作為一種順式增強子序列，對下游靶基因表達的調控有重要作用[19]。氧化應激時，正常狀態下的Keap1-Nrf2聚合物將會因為Keap1半胱氨酸殘基的氧化而解離，致使Nrf2 進入細胞核內并與ARE結合，從而激活下游抗氧化酶(如血紅素氧合酶-1、谷氨酸半胱氨酸連接酶)的轉錄[18]。Keap1-Nrf2-ARE對調節細胞氧化還原狀態維持細胞穩態有著重要作用[20]。已有研究證明，檸檬苦素(Limonin)可通過激活Nrf2抗氧化途徑來減輕APAP誘導的肝毒性[21]。另外，yan等[22]發現，天然產物穿心蓮內酯(andrographolide)可通過激活Nrf2并增加其下游基因表達來減輕APAP引起的肝損傷。

四、TRPM2通道激活

瞬時受體電位陽離子通道亞家族M成員2(transient receptor potential cation channel subfamily M member 2,TRPM2)是位于細胞膜上的非選擇性陽離子通道，具有二磷酸腺苷核糖(adenosine diphosphoribose,ADPR)水解酶活性。氧化應激時，活性氧激活聚ADPR聚合酶(PARP)，進而誘導ADPR的產生和TRPM2通道激活，使Ca2+內流增加；采用SiRNA阻斷TPMP2表達可保護APAP誘導肝細胞損傷；同樣，與野生型小鼠相比，TRMP2-/-小鼠APAP肝毒性明顯減輕，這表明TRMP2通道在APAP所致肝損傷中起著重要作用[23]。姜黃素(Curcumin)是一種新型的TRPM2通道抑制劑，可用于APAP肝損傷的治療[24]。另一方面，活性氧激活CaMKII蛋白(Ca2+/calmodulin-dependent kinase II)，最終導致BECN1蛋白的磷酸化[25]。BECN1蛋白包含Bcl-2同源性(BH3)結構域、卷曲螺旋結構域(CCD)和進化保守結構域(ECD)，在自噬中起著至關重要的作用[26]。磷酸化的BECN1會與PIK3C3(Phosphoinositide-3-Kinase Class 3)分離抑制自噬，并與BCL2或BCL2L1(BCL2 Like 1)結合，從而導致BAX(與BCL2相關的X蛋白)與BCL2分離，誘導凋亡，使用CaMKII抑制劑KN-93治療可減輕小鼠APAP肝損傷[27]。

Keap1:Kelch樣ECH相關蛋白1；Nrf2:核因子類紅細胞2-相關因子2；ARE:抗氧化反應元件；HO-1:血紅素氧合酶-1；GCL:谷氨酸半胱氨酸連接酶；Cytochrome C:細胞色素C；mtDNA:線粒體DNA；Endo G:線粒體蛋白內切核酸酶G；AIF:凋亡誘導因子；MPT:線粒體膜通透性轉變；MPTP:線粒體膜通透性轉換孔；GSK-3β:糖原合酶激酶3β；MLK3:下游混合譜系激酶3；ASK-1:凋亡信號調節激酶1；Sab蛋白:優先與Btk結合的SH3結構域結合蛋白；SHP1:非受體型6 蛋白酪氨酸磷酸酶；PARP:聚ADPR聚合酶；ADPR:二磷酸腺苷核糖；TRPM2:瞬時受體電位陽離子通道亞家族M成員2；CAMKⅡ:鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ圖2 APAP毒性作用下主要分子機制

五、線粒體通透性改變

線粒體同樣是APAP的作用靶點，當APAP與線粒體蛋白質結合時會導致線粒體電子傳遞鏈的紊亂以及線粒體氧化應激。氧化應激所產生的過氧化物、過亞硝酸鹽等作用于線粒體時將會造成線粒體通透性的改變(mitochondrial permeability transition,MPT)。此時，一種非特異性孔——線粒體通透性過渡孔(MPTP)將會打開，使得線粒體對分子量小于1.5 kDa 的陰陽離子溶質的通透性突然增加[28]。

MPTP是一種由腺嘌呤核苷酸轉位酶(ANT)、電壓依賴性陰離子通道(VDAC)親環蛋白D(cyclophilin D)構成的蛋白組合體[29]。鈣離子積聚以及ROS均可導致MPTP的開放[30]。從而導致機制代謝物(最高不超過1 500 kDa)、線粒體蛋白內切核酸酶G(endonuclease G)、凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)以及線粒體DNA釋放進入細胞質[31]。核酸內切酶G和AIF的釋放可促進DNA裂解和細胞壞死，mtDNA可以觸發TOLL樣受體9(TLR9)誘導促炎性介質的表達和中性粒細胞的浸潤以加重肝損傷[32]。

六、總結及展望

APAP造成的肝損傷有明顯的劑量依賴性且作為機制較為復雜，除了目前較為明確的氧化應激，還可造成炎癥反應[33]、內質網應激等，具體分子機制涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)激活、Keap1-Nrf2-ARE信號激活、線粒體膜通透性轉變(mitochondrial membrane permeability transition,MPT)等等。

NAC(N-acetyl cysteine,N-乙酰-L-半胱氨酸)是含有巰基的抗氧化劑，體內代謝后去乙酰化生成半胱氨酸，并在肝細胞內進一步轉化為谷氨酰半胱氨酸，然后在GSH合酶的作用下生成谷胱甘肽，從而達到解毒的作用。NAC雖然被廣泛承認并且大量應用于臨床APAP肝損傷治療,但是其作用具有時間局限性，NAC對APAP導致肝毒性8 h內有較好的療效，一旦超出時間范圍，療效將逐漸減弱[34]。同時，靜脈注射NAC可導致靜脈蕁麻疹瘙癢等不良反應。因而，探究APAP肝毒性的分子機制仍有重要意義，并且有助于基于APAP的分子作用機制尋找潛在的治療靶點，從而更好防治APAP藥物性肝損傷的發生。