結直腸癌中循環腫瘤細胞的表達及與Ki-67 的關系研究△

林琳，李奇棟，張忠慧，孫利君，許慶文，徐飛鵬

廣東醫科大學附屬醫院胃腸外科，廣東 湛江 524000

結直腸癌發病率居全球惡性腫瘤第三位，2020年全球癌癥統計數據顯示，中國結直腸癌新發56萬例，病死29 萬例。隨著醫療技術的不斷發展，結直腸癌診斷率和治療效果明顯提高，但由于結直腸癌患者的遠處轉移率較高，有研究發現，遠處轉移結直腸癌患者的5 年生存率明顯降低，接受根治性手術的結直腸癌患者中，仍有20%～45%的患者可能出現復發或遠處轉移，由此可見，轉移和復發是影響結直腸癌患者遠期生存的重要因素，因此，深入探討結直腸癌的復發轉移機制，有助于結直腸癌的診斷和治療。

1869 年，Ashworth 首次提出了循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）的概念，指實體腫瘤細胞在多種細胞因子的作用和調控下，從腫瘤組織脫落或進入循環系統，這其中絕大多數腫瘤細胞在免疫系統及自身凋亡的作用下死亡，只有極少數的腫瘤細胞能夠存活下來，這些存活下來的細胞具有極高的侵襲性和轉移傾向，其可發生黏附、聚集并在特定的條件下形成腫瘤微栓，實現腫瘤的侵襲和轉移。隨著科學技術的發展，使外周血CTC 檢測成為可能。Ki-67 又稱細胞增殖核抗原，因其只表達于增殖細胞中，表明其表達水平與細胞增殖密切相關。本研究采用CanPatrol二代檢測技術分離富集和分析鑒定結直腸癌患者外周血中的CTC，檢測結直腸癌中CTC 及其分型的表達情況，并分析CTC、mCTC、Ki-67 與患者臨床特征的關系，分析結直腸癌患者CTC 及其分型的表達與Ki-67 表達的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年12 月至2019 年12 月廣東醫科大學附屬醫院收治的結直腸癌患者。納入標準：均經內鏡病理或手術切除病理明確診斷為結直腸癌，且均為初次診斷；均行標準結直腸癌根治手術治療。排除合并其他系統惡性腫瘤的患者。依據納入和排除標準，本研究共納入230 例結直腸癌患者，其中男147 例，女83 例；年齡23～89 歲，中位年齡63 歲；TNM 分期：Ⅰ期27 例，Ⅱ期96 例，Ⅲ期107 例；腫瘤部位：升結腸63 例，降結腸19 例，乙狀結腸58 例，直腸90 例；腫瘤最大徑：≥5 cm 89例，﹤5 cm 141 例；分化程度：低分化58 例，中分化144 例，高分化28 例；浸潤深度：T期10 例，T期28例，T期78 例，T期114 例；合并淋巴結轉移107例，無淋巴結轉移123 例；神經侵犯98 例，無神經侵犯132 例；脈管侵犯53 例，無脈管侵犯177 例。

1.2 方法

1.2.1 CTC 的檢測方法 抽取230例結直腸癌患者空腹外周靜脈血5 ml，置于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）試管中，800～1000 r/min離心5～8 min，加入紅細胞裂解液后再次離心，移除破碎的紅細胞，加入4%多聚甲醛固定液固定10 min。使用由真空歧管連接裝有8 μm 孔校準膜的過濾器和迷你臺式真空泵過濾樣本，壓力為0.08 MPa，再次置于含4%甲醛的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）中固定60 min，完成CTC 的分離富集。CTC 的分型檢測于24 孔板上進行，采用多重mRNA 原位分析法，使用多種特異性針對CTC 的RNA探針，分別對表達上皮表型基因[如上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、CK8、CK18、CK19]的CTC 和表達間質表型基因[波形蛋白（vimentin）、twist]的CTC 以及區別CTC 和白細胞的特異性核酸探針（CD45）進行不同熒光染色標記。具體操作過程如下：對分離富集后的樣本進行透化和消化處理，加入3 組探針工作液置于恒溫培養箱中靜置120 min，后進行預擴增（30%馬血清、1.5%十二烷基硫酸鈉、3 mmol/L pH=8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、0.5 fmol 預擴增序列）、擴增（30%馬血清、1.5%十二烷基硫酸鈉、3 mmol/L pH=8.0 的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、1.0 fmol的擴增序列）、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色處理，以上步驟過程均使用PBS 沖洗3次，每次2 min。最后采用熒光顯微鏡觀察并分析熒光信號。

1.2.2 免疫組化法檢測Ki-67 表達情況 取230 例結直腸癌患者的結直腸癌組織，置于10%福爾馬林固定液中固定24～48 h，清水沖洗后將其浸泡于不同濃度的乙醇溶液中脫水，經二甲苯透明，病理組織包埋機石蠟包埋，切片，厚度為4 μm。經過烤片、二甲苯、乙醇脫水及水化處理，加入檸檬酸修復液加熱，冷卻至室溫，PBS 沖洗3 次，加入3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，PBS 沖洗3 次后滴加Ki-67 抗體，4 ℃孵育過夜；加入羊抗兔多克隆免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體，室溫孵育30 min，PBS 沖洗3 次，DAB 顯色，自來水重復沖洗2～3 次。蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.3 結果判定 不同特異性探針雜交染色后，識別不同的熒光信號點，可將CTC 分為上皮型CTC（epithelial CTC，eCTC）、混合型CTC（biophenotypic CTC，bCTC）和間質型CTC（mesenchymal CTC，mCTC）（圖1）。將結直腸癌患者外周血CTC≥3/5 ml判定為陽性，﹤3/5 ml 判定為CTC 陰性；eCTC、bCTC、mCTC≥1/5 ml 判定為陽性，﹤1/5 ml 判定為陰性；Ki-67 主要定位于細胞核，細胞核呈棕黃色染色判定為陽性。

圖1 熒光顯微鏡下結直腸癌患者外周血CTC分型（熒光染色，×400）

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件對所有數據進行統計分析；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用

χ

檢驗，以

P

﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌患者CTC 表達情況

230 例結直腸癌患者中，207 例患者檢出CTC，檢出率為90%（207/230），其中159例檢出CTC陽性，陽性率為69.13%（159/230）；CTC 計數0～143/5 ml，平均12.6/5 ml，中位5/5 ml。eCTC、bCTC、mCTC陽性率分別為50.00%（115/230）、66.96%（154/230）、71.30%（164/230）；不同TNM 分期結直腸癌患者CTC 表達情況結果顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者CTC 陽性率分別為55.56%、64.58%、76.64%，mCTC 陽 性 表 達 率 分 別 為51.85% 、66.71% 、79.44%，CTC、mCTC 陽性表達率隨臨床分期的升高而逐漸升高（表1）。

表1 不同臨床分期結直腸癌患者CTC 及其分型的陽性表達情況[n（%）]

2.2 不同臨床特征結直腸癌患者CTC、mCTC、Ki-67 表達情況比較

230 例結直腸癌患者中，Ki-67≥60%患者195例，Ki-67﹤60%患者35 例。不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、浸潤深度、神經侵犯情況、脈管侵犯情況結直腸癌患者CTC、mCTC、Ki-67 表達情況比較，差異均無統計學意義（

P

﹥0.05）。不同分化程度、淋巴結轉移情況、TNM 分期結直腸癌患者血清CTC 陽性表達率比較，差異均有統計學意義（

χ

=7.606、5.281、5.281，

P

﹤0.05）。不同分化程度、淋巴結轉移情況、TNM 分期結直腸癌患者血清mCTC 陽性表達率比較，差異均有統計學意義（

χ

=14.852、6.471、6.471，

P

﹤0.05）。不同分化程度、淋巴結轉移情況、TNM 分期結直腸癌患者結直腸癌組織中Ki-67≥60%表達率比較，差異均有統計學意義（

χ

=8.283、5.347、5.347，

P

﹤0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征結直腸癌患者的CTC、mCTC、Ki-67 表達情況

2.3 不同Ki-67 表達水平結直腸癌患者CTC 及分型陽性表達情況比較

Ki-67≥60%與Ki-67﹤60%結直腸癌患者CTC、eCTC、bCTC 陽性表達率比較，差異均無統計學意義（

P

﹥0.05）。Ki-67≥60%結直腸癌患者mCTC 陽性表達率為73.85%（144/195），高于Ki-67﹤60%患者的57.14%（20/35），差異有統計學意義（

χ

=4.046，

P

﹤0.05）。（表3）

表3 不同Ki-67 表達水平結直腸癌患者CTC 及分型陽性表達情況比較

3 討論

目前，結直腸癌的輔助診斷、療效評估及預后監測手段主要包括血清腫瘤標志物[如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）]檢測、影像學檢查[如CT、MRI、超聲、正電子發射計算機斷層顯像（position emission tomography，PET）-CT]、內鏡及病理組織活檢等。但上述檢查手段或多或少存在著一些不足，CEA 水平升高表明消化道腫瘤、泌尿系腫瘤、乳腺癌及肺癌等惡性腫瘤的存在，但在結腸炎、胰腺炎等良性病變中也存在CEA 水平升高，長期合并心腦血管疾病、糖尿病等慢性疾病患者的血清CEA 水平也會升高，表明CEA 的特異度較低。CT、MRI、PET-CT 及內鏡等影像學檢查雖然能夠直觀地顯示腫瘤病灶，但并不能及時發現隱匿性、轉移灶或微小的術后殘留病灶，具有一定的滯后性。組織活檢是結直腸癌的診斷金標準，但存在多次反復取檢、創傷較大、特殊部位難以取檢、存在一定假陰性或無法動態監測的可能。因此，亟需尋找一種能早期發現腫瘤、動態監測療效、預后評估的生物學指標。

本研究結果發現，腫瘤細胞經上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）后，其原有上皮表型的蛋白表達下調，而間質型表型的蛋白表達上調，即細胞發生細胞極性丟失，從而增強了細胞的運動能力，使其從原腫瘤組織脫落，或進入循環系統，形成CTC，為腫瘤的遠處轉移打下基礎。Wong 等納入132 例結直腸癌患者，結果發現，62%的患者呈CTC 陽性，且CTC 計數與淋巴結轉移情況相關。吳志清納入60 例結直腸癌患者發現，外周血CTC 陽性表達率與TNM 分期、浸潤深度、淋巴結轉移情況、分化程度密切相關。葛祖蔭等研究發現，低中分化結直腸患者的CTC陽性表達率高于高分化的結直腸癌患者。本研究納入230 例結直腸癌患者，結果顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者CTC 陽性率分別為55.56%、64.58%、76.64% ，mCTC 陽 性 表 達 率 分 別 為51.85% 、66.71%、79.44%，表明CTC、mCTC 陽性表達率隨結直腸癌患者病情的進展而升高。此外，本研究結果顯示，不同分化程度、淋巴結轉移情況、TNM 分期結直腸癌患者CTC、mCTC 陽性表達率比較，差異均有統計學意義（

P

﹤0.05），表明CTC 及mCTC可能對結直腸癌患者的預后評估有重要意義。發生脈管侵犯的結直腸癌患者的mCTC 陽性表達率高達81.13%，高于無脈管侵犯患者的68.36%，雖然差異無統計學意義（

P

﹥0.05），但也提示，mCTC 可能參與結直腸癌的血行轉移過程。Ki-67 由

MKI

-

67

基因編碼，是一種存在于細胞核的非組蛋白，其不表達于細胞周期G期，而在G期開始表達，S 期及G期開始增加，至M 期達到頂峰，隨后表達水平迅速降低，往復循環。有研究認為，Ki-67 的表達水平與細胞增殖密切相關，但其表達水平與結直腸癌患者臨床特征的關系尚未完全闡明。趙巖等納入50 例結直腸癌，結果發現，Ki-67 表達水平與淋巴結轉移情況、分化程度及Dukes 分期有關，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤最大徑和浸潤深度無關。王曉元等的研究發現，Ki-67 的表達水平與浸潤深度、TNM 分期、淋巴結轉移情況、脈管侵犯情況有關，而與年齡、性別、腫瘤最大徑和分化程度無關。本研究結果發現，結直腸癌患者Ki-67 表達情況與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、浸潤深度、神經侵犯情況、脈管侵犯情況可能無關，與分化程度、淋巴結轉移情況、TNM 分期可能有關。表明Ki-67 在結直腸癌進展、侵襲轉移過程中發揮重要作用，其表達水平較高提示腫瘤細胞的侵襲轉移能力強，患者的預后不良。

本研究進一步探討CTC 及其分型的表達與Ki-67 表達的關系，結果發現，Ki-67≥60%與Ki-67﹤60%結直腸癌患者CTC、eCTC、bCTC 陽性表達率無明顯差異，但Ki-67≥60%結直腸癌患者的mCTC陽性表達率為73.85%，高于Ki-67﹤60%患者的57.14%。Gasinska 等的研究發現，惡性腫瘤細胞的EMT 可能與vimentin、N-鈣黏素（N-cadherin）、Ki-67、survivin 的高表達及E-鈣黏素（E-cadherin）和磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的低表達有關。此外，惡性腫瘤的發生發展過程中，常伴隨腫瘤微環境的改變，其中腫瘤細胞過快增殖導致組織缺氧和腫瘤細胞壞死所致的炎性反應也是特征表現。而在缺氧的條件下，腫瘤細胞可通過缺氧誘導因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）激活twist 的表達從而啟動EMT過程。白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）可通過JAK-信號轉導與轉錄激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）通路誘導snail1 的表達來促進EMT 過程。上述研究均表明，Ki-67 高表達可能與EMT 密切相關，為證實Ki-67 表達與CTC 及mCTC 有關的假設提供了理論可能。

綜上所述，結直腸癌患者外周血中檢測到CTC 及mCTC 的表達提示腫瘤進展及潛在復發轉移的可能，對評估患者的預后有一定的參考價值，Ki-67 表達水平與mCTC 的表達可能有關，但仍需進一步深入研究。