苗藥痛風停湯對高尿酸血癥大鼠降尿酸機制研究

曹躍朋 馬武開 劉正奇 安 陽1 張雄峰 張藝 曾商禹 鐘琴

摘要 目的：通過探討痛風停湯對高尿酸血癥大鼠血尿酸水平、血清黃嘌呤氧化酶（XO）濃度、腎小管上皮細胞的尿酸鹽轉運體（UAT）mRNA和尿酸鹽陰離子轉運蛋白1（URAT1）mRNA的表達的影響，研究苗藥痛風停湯的具體降尿酸作用機制。方法：將56只SD大鼠隨機分為苗藥痛風停高、中、低組、空白組和模型組、別嘌醇組、苯溴馬隆組。除空白組每天給予普通飼料喂養外，其余各組均造成高尿酸血癥大鼠模型。模型組和空白組均予等量生理鹽水灌胃，其余各組分別予相對應藥物灌胃，給藥7 d后檢測各組血清XO活性、尿酸及腎小管上皮細胞UATmRNA、URAT1mRNA的表達。結果：與模型組比較，1）降XO，除苯溴馬隆組、苗藥痛風停低劑量組，其余各組均可降低血清XO濃度（均P<0.01）;別嘌醇組與苗藥痛風停高、中劑量組療效相當（P>0.05）。痛風停高、中劑量組比低劑量組降低XO效果更佳（P<0.05）。2）降尿酸，除苗藥痛風停低劑量組，其余各觀察組均有較好的降尿酸作用（均P<0.01）;痛風停高、中劑量組與別嘌醇組、苯溴馬隆組降尿酸效果相當（P>0.05）。3）調節UATmRNA表達，痛風停高劑量組可以上調UATmRNA表達（P<0.01），其余各組差異均無統計學意義（均P>0.05）。4）調節URATlmRNA表達，苗藥痛風停高、中劑量組及苯溴馬隆組均可以下調URATlmRNA表達（P<0.05），且效果相當（P>0.05）。其余各組差異均無統計學意義（均P>0.05）。結論：苗藥痛風停湯可能通過抑制黃嘌呤氧化酶活性及上調UATmRNA、下調URAT1mRNA的表達達到降低高尿酸血癥大鼠血尿酸濃度。

關鍵詞 苗藥痛風停湯;高尿酸血癥;實驗研究;黃嘌呤氧化酶;尿酸鹽轉運體

Study on the Mechanism of Miao Medicine Tongfengting Decoction on Decreasing Uric Acid in Hyperuricemia Rats

CAO Yuepeng1， MA Wukai1， LIU Zhengqi1， AN Yang1， ZHANG Xiongfeng1， ZHANG Yi2，3， ZENG Shangyu2，3， ZHONG Qin1

（1 The Second Affiliated Hospital， Guiyang University of Chinese Medicine， Guiyang 550003， China; 2 Research Center for

Academic Inheritance and Innovation of Ethnic Medicine of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu

611137， China; 3 College of Ethnic Medicine in Chengdu University of Traditional Chinese， Chengdu 611137， China）

Abstract Objective：To explore the effects of Tongfengting Decoction on serum uric acid level， serum XO concentration， UAT mRNA and URAT1 mRNA expression of renal tubular epithelial cells of hyperuricemia rats， and study the specific mechanism of uric acid-lowering effect of Miao medicine Tongfengting Decoction. Methods：A total of 56 SD rats were randomly divided into a Tongfengting low dose group， a medium dose group and a high dose group， a blank group， a model group， an allopurinol group and a benzbromarone group. Except for the blank group， which was fed to the common diet daily， the other groups were prepared into hyperuricemia model. The model group and the blank group were given the same amount of normal saline， and the other groups were given the corresponding drugs. All rats were dosed for 7 days， and on the seventh day after dosing， the serum uric acid level， serum XO concentration， UAT mRNA and URAT1 mRNA expression of renal tubular epithelial cells of every group rats were detected. Results：Compared with the model group：1）on decreasing the XO：except for the benzbromarone group and the Miao medicine Tongfengting low dose group， and the other groups can reduce the serum XO concentration（P<0.01）; the efficacy of the allopurinol group was similar to that of the Miao medicine Tongfengting high dose group and medium dose group（P>0.05）. The efficacy of the high dose group and medium dose group of Tongfengting were better than that of the low dose group（P<0.05）. 2）on reducing the uric acid level：except for the Miao medicine Tongfengting low dose group， the other treatment groups had better uric acid-lowering effect（P<0.01）; the efficacy of reducing uric acid level of the Miao medicine Tongfengting high dose group， medium dose group and the allopurinol group， the benzbromarone group were similar（P>0.05）. 3）on regulating the expression of UATmRNA：the UATmRNA expression was up-regulated in the Miao medicine Tongfengtin high dose group（P<0.01）， and the other groups were not statistically significant（P>0.05）. 4）on regulating the expression of URAT1mRNA：the URT1mRNA expressions were down-regulated in the Miao medicine Tongfengtin high dose group， medium dose group and the benzobromoma group（P<0.05）， and the efficacy of these groups were similar（P>0.05）. The other groups were not statistically significant（P>0.05）. Conclusion：The Miao medicine Tongfengtin Decoction can reduce the serum uric acid concentration in hyperuricemia rats by inhibiting the activity of xanthine oxidase， up-regulating the expression of UATmRNA and down-regulating the expression of URAT1mRNA.

Keywords Miao medicine Tongfengtin; Hyperuricemia; Experimental study; Xanthine oxidase; Urate transporter

中圖分類號：R29;R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.005

痛風（Gout）是由于長期體內嘌呤代謝紊亂或者尿酸排泄障礙而引起血尿酸升高、單鈉尿酸鹽（Monosodium Urate，MSU）沉積于關節所致的一種疾病，屬于代謝性風濕病[1]。以反復的局部關節突發疼痛、局部或全身痛風石形成及引起關節變形、腎臟功能損害及泌尿系結石甚至發生腎臟衰竭等為臨床特征。本病屬于中醫學“痹證（熱痹）”“歷節”“痛風”等范疇。“濕熱”是歷代醫家認為痛風發病的一個重要病因，有研究表明濕熱蘊結證是急性痛風性關節炎中醫證的髙發證型[2]。中醫的“濕熱蘊結”與苗醫藥中“火毒”理論在病機及對其治則上相一致。基于此，我們將中醫理論與苗醫相結合，提出痛風的發病是由于濕濁久蘊，化瘀化熱，終成“瘀毒”所致，治療當以“清濁、解毒、化瘀”為主，應用貴州苗族民間草藥組成痛風停方。在前期實驗研究及臨床觀察中我們發現苗藥痛風停湯對痛風性關節炎療效確切，且未出現明顯的不良反應[3-5]。本研究通過構建高尿酸血癥大鼠模型，加入苗藥痛風停湯進行干預，探討痛風停湯對高尿酸血癥大鼠血尿酸水平、血清黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XO）濃度、腎小管上皮細胞的尿酸鹽轉運體（Urate Transporter，UAT）mRNA和尿酸鹽陰離子轉運蛋白1（Urate-anion Transporter1，URAT1）mRNA表達的影響，研究苗藥痛風停湯的具體降尿酸的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取4周齡清潔級SD雄性大鼠56只，平均體質量（200±20）g，購自于重慶滕鑫生物公司，許可證號：SCXK-（軍）2012-0011。在貴陽中醫學院實驗動物中心同等條件下飼養。動物實驗中心采用空調控溫，室溫18～25 ℃，濕度55%～65%，12 h光照/黑暗循環，室內有換氣設備。分籠飼養，采取自由進食和飲水，每天更換木屑等墊料，大鼠適應1周后開始實驗。給予大鼠以人道關懷。符合中華人民共和國衛生部動物實驗倫理管理條例（No.55，2001）和貴陽中醫學院實驗動物管理條例規定。

1.1.2 藥物 別嘌醇片[世貿天階制藥（江蘇）有限責任公司，批號：20101047]。苯溴馬隆（宜昌長江藥業公司，批號：36384）。苗藥痛風停方（大血藤、觀音草、芭蕉根、絡石藤、生石膏、川牛膝、川萆薢等）購買于貴陽中醫學院第二附屬醫院制劑室。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠黃嘌呤氧化酶ELISA試劑盒（Rat XO ELISA KIT）（貴州賽蘭博有限科技公司，批號：20171012）;5%羧甲基纖維素鈉（天津市恒興化學試劑制造有限公司，批號：20110728）;氧嗪酸鉀鹽（Sigma公司，美國，批號：101310713）;10%的酵母飼料（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20130602）。ELISA酶標儀（Thermo Fisher Scientific Oy，美國，型號：Bio-TeKELx800V型）;臺式高速冷凍離心機（長沙邁佳森儀器設備有限公司，型號：TGL20M）;實時定量PCR儀器（Bio-Rad Laboratories，Inc，美國，型號：CFX96;）;電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司，型號：HWS12）;-20 ℃冰箱（中科美菱，型號：DW-FL270）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將56只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、痛風停低劑量組、痛風停中劑量組、痛風停高劑量組、別嘌醇組、苯溴馬隆組，共7組，每組8只。空白對照組每天給予蒸餾水10 mL/kg灌胃，普通飼料喂養。除空白組外，其余各組大鼠均予造模：將25 g氧嗪酸鉀鹽溶于0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）500 mL溶液中，250 mg/（kg·d）腹腔注射，同時給予質量分數10%的酵母飼料100 g/（kg·d）喂養，連續7 d。在造模第7天通過吸入異氟烷麻醉大鼠后，經大鼠眼球后靜脈叢取血1～1.5 mL，檢測血清尿酸含量，若血清尿酸值高于正常組均值20%，說明高尿酸血癥模型大鼠造模成功。

1.2.2 給藥方法與取材 痛風停總生藥量為148 g，按照成人標準體質量60 kg根據人與大鼠體質量確定大鼠等效劑量為中劑量約為（3.7 g/kg），等效劑量的1/2倍為低劑量（1.85 g/kg），等效劑量的2倍為高劑量（7.4 g/kg）[6]。別嘌醇取等效劑量0.3 mg/kg，苯溴馬隆取等效劑量為0.1 mg/kg。大鼠正常飼養1周后，參照上述造模，第7天目內眥取血測定用藥前血尿酸濃度。造模成功后分別給藥灌胃，其中模型對照組和空白對照組灌服等量生理鹽水，各組連續給藥7 d，1次/d。

1.2.3 檢測指標與方法 于給藥第7天給藥后2 h開腹進行腹主動脈取血測定大鼠用藥后血尿酸、肌酐、尿素等濃度，并分離血清，測定血清中黃嘌呤氧化酶濃度，留取腎臟標本，檢測腎小管上皮細胞中的UATmRNA和URAT1mRNA的表達量。

1.2.3.1 尿酸酶-過氧化物酶偶聯法檢測血尿酸水平，堿性苦味酸終點比色法檢測血肌酐水平。

1.2.3.2 酶聯免疫吸附測定法檢測血清黃嘌呤氧化酶活性 第14天給藥后2 h開腹后進行腹主動脈取血，以3 000～3 500 r/min的速度，離心半徑15 cm，離心10 min，將血清和紅細胞迅速小心的分離，采用ELISA法檢測大鼠血漿黃嘌呤氧化酶活性，按照ELISA試劑盒要求，吸取澄清上清液進行檢測黃嘌呤氧化酶含量。

1.2.3.3 反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測腎小管上皮細胞中的UATmRNA和URAT1mRNA的表達量 RT-PCR法操作步驟根據說明書進行，等待反應結束后，讀取并記錄目的基因及內參基因的Ct值;將電腦中的數據拷出并計算目的基因的相對表達量（相對表達量用2-△△Ct表示）;PCR條件如圖1。引物設計見表1。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，所有計量資料以均數±標準差描述，多組間采用單因素方差分析，2組間比較用t檢驗，不同時間點數據采用重復測量的方差分析，方差齊時，各組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時，則采用Tamhance′s T2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗過程中動物耗損情況 實驗過程中所有動物均未脫落。

2.2 各組血清XO濃度比較 與空白組比較，模型組XO濃度差異有統計學意義（P=0.000<0.05）;與模型組比較，苗藥痛風停高、中組及別嘌醇組XO濃度均明顯低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;與別嘌醇組比較，苗藥痛風停低劑量組、苯溴馬隆組差異有統計學意義（P<0.05），苗藥痛風停高、中劑量組與別嘌醇組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組用藥前后血尿酸比較 模型組與空白組比較，差異有統計學意義（P<0.05），提示造模成功;與本組用藥前比較，除痛風停低劑量組以外，其余各觀察組尿酸值均明顯下降（P<0.05）;與模型組比較，痛風停高、中劑量組、別嘌醇組、苯溴馬隆組均有較明顯的降尿酸作用（P<0.05）;苗藥痛風停高、中劑量組降尿酸作用與別嘌醇、苯溴馬隆相當（P>0.05），但優于低劑量組（P<0.05）。見表3。

2.4 各組用藥前后血肌酐比較 各組用藥前后，測量血肌酐濃度，組內及組間比較差異均無統計學意義（均P>0.05）。見表4。

2.5 細胞總RNA的檢測

2.5.1 內參基因β-actin的RT-PCR曲線圖 見圖2、3。

2.5.2 目的基因UAT的RT-PCR曲線圖 見圖4、5。

2.5.3 目的基因URATl的RT-PCR曲線圖 見圖6、7。

2.6 目的基因UAT、URATl定量結果

2.6.1 UATmRNA基因相對表達量比較 空白組與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.01），提示造模成功。與模型組比較，痛風停高劑量組可以增加UATmRNA基因表達，差異有統計學意義（P<0.01），其余各組均無統計學意義（均P>0.05）。見表5。

2.6.2 UAT和URAT1mRNA基因相對表達量比較：空白組與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.01），提示造模成功。與模型組比較，苗藥痛風停高、中劑量組及苯溴馬隆組URAT1mRNA基因表達均低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），且3組療效相當（P>0.05）。余各組差異均無統計學意義（均P>0.05）。見表5。

3 討論

痛風性關節炎的發病機制仍未明確，目前比較一致的觀點是各種原因引起的高尿酸血癥。有學者研究發現高尿酸血癥患者有5%～12%的概率可進一步發展成為痛風[7-8]，而80%～90%的痛風患者伴隨著高尿酸血癥[9]。XO是嘌呤分解代謝最后步驟中一種很重要的酶，主要參與核酸的代謝[10]，次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成黃嘌呤，再進一步生成尿酸和自由基[11]。研究發現，XO活性增高可以導致原發性高尿酸血癥和痛風[12]。對XO的研究是抗高尿酸血癥和痛風藥物研究的重點。

人體尿酸的以腎臟排泄途徑為主，經尿道排出，約占總排泄量的2/3;其次為腸道排泄，或在腸道內被細菌尿酸氧化酶分解，約占總排泄量的1/3[13]。目前有4種尿酸鹽轉運蛋白參與人近曲腎小管轉運[14]：生電型的尿酸鹽轉運子/通道（Human Urate Transporter，hUAT）、電中性的尿酸鹽/陰離子交換子（Human Urate Anionex Changer，hURAT1）、有機陰離子家族成員（Human Organic Anion Transporter，hOAT1）hOAT1和（Human Organic Anion Transporter，hOAT3）hOAT3[15]。其中hURAT1是維持血尿酸水平的關鍵離子通道，位于近端腎小管上皮細胞刷狀緣，主要參與近曲腎小管對尿酸鹽的重吸收。膜表達蛋白hUAT作為貫穿細胞膜的高度選擇性離子通道，是生電型尿酸鹽/陰離子交換體，主要參與腎近曲小管對尿酸鹽的分泌，為調節腎尿酸分泌的關鍵物質[16-17]。故hUAT蛋白或基因表達下降，hURAT1基因或蛋白表達提高為HUA發病的可能機制[18-19]。

本實驗結果提示，在降低黃嘌呤氧化酶濃度方面：除苯溴馬隆組、苗藥痛風停低劑量組以外，其余各組均可降低黃嘌呤氧化酶濃度，差異有統計學意義，苗藥痛風停高、中劑量組與別嘌醇組降尿酸作用相當，其療效比低劑量組明顯。在降尿酸方面：各觀察組與模型組比較，苗藥痛風停高、中劑量組及別嘌醇組、苯溴馬隆組均有較明顯的降尿酸作用。苗藥痛風停高、中劑量組療效明顯，且與別嘌醇、苯溴馬隆相當。對于UATmRNA基因相對表達量的影響，苗藥痛風停高劑量組可以上調UATmRNA基因表達;對于URAT1mRNA基因相對表達量的影響，苗藥痛風停高、中劑量組、苯溴馬隆組可以下調URAT1mRNA基因表達，且作用相當;故苗藥痛風停湯可降低高尿酸血癥大鼠血尿酸含量，以苗藥痛風停高、中劑量組療效較好，呈劑量依賴性。其降尿酸作用可能是通過抑制URATl基因的表達、上調UAT基因的表達，抑制黃嘌呤氧化酶活性共同實現的。

綜上所述，我們認為苗藥痛風停湯能夠通過抑制黃嘌呤氧化酶活性及上調UATmRNA、下調URAT1mRNA的表達實現降尿酸作用，且其不良反應小，值得在臨床上進一步推廣使用。

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（2021-06-10收稿 責任編輯：王明）

基金項目：國家重點研發計劃項目（2017YFC1703904）;國家自然基金項目（81660811）;貴州省科技計劃項目（黔科合LH字[2016]7128號）;貴陽市科技計劃項目（筑科合同[2019]-9-4-27號）;貴州省教育廳青年科技人才成長項目（黔教合KY字[2018]217）

作者簡介：曹躍朋（1986.02—），男，碩士研究生，主治醫師，研究方向：中西醫結合風濕免疫病防治，E-mail：1037481658@qq.com

通信作者：鐘琴（1963.04—），女，本科，主任醫師，研究方向：中西醫結合風濕免疫病防治，E-mail：gycyp2013@163.com