新生兒人雙埃柯病毒的檢測(cè)及遺傳特性分析

李紅，唐煒，呂進(jìn)泉

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

雙埃柯病毒屬(parechovirus)被分為A、B、C、D、E、F 6種，其中parechovirus A又叫人雙埃柯病毒(human parechovirus，HPeV)，被細(xì)分為HPeV-1至HPeV-19基因型。HPeV是一種無(wú)包膜的病毒，其單鏈正向RNA基因組長(zhǎng)度約為7.35 kb，包括1個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)[1]。HPeV在兒童中廣泛流行，可在多種兒童疾病(皮疹、腦炎、腦膜炎、膿毒癥，甚至嚴(yán)重的擴(kuò)張型心肌病)中檢測(cè)出該病毒[2]。近年來(lái)，HPeV引起新生兒神經(jīng)系統(tǒng)感染及敗血癥病例報(bào)告逐漸增多[3-5]，研究表明HPeV可能與嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育延遲相關(guān)[6]。

感染HPeV的兒童可表現(xiàn)為非特異性癥狀或無(wú)癥狀，常在病原檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)。目前病毒感染主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，包括病毒抗體檢測(cè)、PCR及病毒培養(yǎng)等技術(shù)，主要針對(duì)已知病毒檢測(cè)，對(duì)于新病毒及高度變異病毒具有一定局限性。HPeV基因組高度可變，給臨床檢測(cè)工作帶來(lái)一定的困難。

病毒宏基因組學(xué)方法可以獲得樣本中所有的病毒核酸，具有了解樣本病毒群落組成以及探索新病毒和高度變異病毒的優(yōu)勢(shì)[7]。本研究采集新生兒糞便樣本，利用病毒宏基因組學(xué)方法檢測(cè)HPeV，并對(duì)HPeV分子特性進(jìn)行初步研究。利用巢氏PCR對(duì)新生兒糞便、血液及鼻咽分泌物進(jìn)行HPeV檢測(cè)，分析HPeV在新生兒中的流行情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年9月至2018年12月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科出生的新生兒195例：早產(chǎn)兒18例，足月兒177例；采集樣本時(shí)新生兒日齡3～7 d 60例， 8～14 d 72例，15～28 d 63例；其中男105例，女90例。

1.2 樣本采集

使用一次性無(wú)RNA酶離心管采集新生兒糞便、血液及鼻咽分泌物樣本各95份，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。在獲得每位新生兒父母的知情書(shū)面同意后采集樣本。

1.3 病毒宏基因組文庫(kù)構(gòu)建

隨機(jī)選取45份糞便樣本，運(yùn)用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)構(gòu)建文庫(kù)，將45份樣本隨機(jī)分為5組，每組9個(gè)樣本，文庫(kù)名分別標(biāo)記為newbornfeces38、newbornfeces39、newbornfeces40、newbornfeces41以及newbornfeces42。病毒宏基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建及生物信息學(xué)分析方法參考文獻(xiàn)[8-9]。

1.3.1 DNA文庫(kù)構(gòu)建 從-80 ℃冰箱中取出樣本置于冰上備用，用杜氏磷酸緩沖液將樣本按照1 ∶5比例重懸，冰上靜置10 min，期間振蕩3次，12 000×g、4 ℃離心5 min。取300 μL上清液至新的1.5 mL 離心管中，保存待用。將各個(gè)文庫(kù)中每個(gè)樣本取100 μL制備成500 μL混合體系，用0.45 μm濾菌器(美國(guó)Millipore 公司)過(guò)濾懸液，以去除真核細(xì)胞、細(xì)菌及微小顆粒物質(zhì)。利用核酸酶(美國(guó)Life Technologie公司)去除各文庫(kù)中無(wú)衣殼蛋白保護(hù)的游離核酸，用核酸提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取病毒核酸，使用文庫(kù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Life Technologic 公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將文庫(kù)中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用Klenow 大片段DNA 聚合酶(美國(guó)New England Biolabs 公司)將單鏈DNA合成雙鏈DNA，使用Viral metagenomics試劑盒(美國(guó)Illumina公司)構(gòu)建DNA文庫(kù)。

1.3.2 文庫(kù)純化與深度測(cè)序 將制備完成的DNA文庫(kù)利用文庫(kù)接頭試劑盒(美國(guó)Illumina 公司)加上接頭后進(jìn)行擴(kuò)增，接著采用Qiaquick PCR純化試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并采用Ampure Beads(美國(guó)Beckman公司)除去文庫(kù)中小的DNA片段和引物二聚體，從而獲得長(zhǎng)度在300～800 bp的DNA文庫(kù)，送至上海生工生物有限公司Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析 通過(guò)Hiseq平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用病毒宏基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)分析平臺(tái)對(duì)測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)各樣品條碼將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分類并輸出，利用Bowite 2軟件除去真核及原核基因序列，再利用VecScreen軟件剪切掉序列兩端的引物和接頭，將純凈的序列組裝拼接形成重疊群，進(jìn)行BlastX搜索，從本地病毒蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和本地非病毒蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索。

1.4 全基因組獲取

選取文庫(kù)原始數(shù)據(jù)中病毒較長(zhǎng)重疊群作為參考序列，利用Geneious 11.1.2軟件在各個(gè)文庫(kù)原始數(shù)據(jù)中進(jìn)行組裝，從而獲取全基因組。

1.5 獲得的HPeV毒株系統(tǒng)發(fā)育及重組分析

從GenBank數(shù)據(jù)中檢索了44條與本研究鑒定的HPeV相關(guān)且具代表性毒株的全基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。使用Mega 7.0進(jìn)行序列多重比對(duì)，以及MrBayes 3.2.7軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

從GenBank中檢索相關(guān)基因組，并使用Mega 7.0進(jìn)行序列多重比對(duì)，再使用RDP4.0評(píng)估重組事件[10]。通過(guò)軟件SimPlot 3.5.1中的相似圖分析所識(shí)別的基因組涉及的重組事件[11]。根據(jù)重組區(qū)域再次進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定重組事件。

1.6 HPeV陽(yáng)性樣本PCR篩查

依據(jù)上述研究獲得的重組HPeV毒株的衣殼蛋白核酸序列，使用Geneious 11.1.2設(shè)計(jì)巢式 PCR引物，對(duì)構(gòu)建文庫(kù)的糞便樣本45份以及其他新生兒鼻咽分泌物樣本95份、血液樣本95份、糞便樣本50份，共285份樣本進(jìn)行陽(yáng)性篩選。外套上游：ACCAGACTGGGTCATTGAG；外套下游：CCTTGCAAGAAG-GCGACAAC；內(nèi)套上游：ACCCTTAGTCAACACCAGGC；內(nèi)套下游：GGACAGACAAGCAGTGGTCA。外套PCR條件：94 ℃預(yù)變性2 min，隨后94 ℃變性20 s，50 ℃退火 20 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。內(nèi)套PCR條件：94 ℃預(yù)變性2 min，隨后94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳目的片段位于306 bp。

2 結(jié)果

2.1 病毒宏基因組文庫(kù)生物信息分析

通過(guò)生物信息學(xué)分析，成功獲得5個(gè)文庫(kù)的病毒核酸序列，文庫(kù)newbornfeces38至newbornfeces42分別檢測(cè)出248 534、277 432、398 756、475 408、130 634條病毒序列，將原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI 的序列讀長(zhǎng)檔案(sequence read archive，SRA)數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為SRX7061110、SRX7063036、SRX7067008、SRX7070136、SRX7070288。在文庫(kù)newbornfeces40和newbornfeces41分別檢測(cè)630和1 792條HPeV序列。將文庫(kù)newbornfeces41的原始序列進(jìn)行組裝，獲得長(zhǎng)度為7 207 bp的完整基因組，命名為newborn_zjlh，并預(yù)測(cè)該基因組包含一個(gè)編碼多聚蛋白的ORF。已將其全基因組序列上傳至 GenBank，登錄號(hào)為MT157224。

2.2 HPeV全基因組分析

HPeV毒株基因組全長(zhǎng)為7 207 bp，線性，兩端為非編碼區(qū)，GC含量39.7%，包含一個(gè)長(zhǎng)度為6 540 bp的ORF，起始于639 bp止于7 178 bp，預(yù)測(cè)編碼由2 179個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白。P1、P2、P3是組成HPeV 多聚蛋白的3個(gè)多肽(圖1)。

5′UTR: 5′端非編碼區(qū)；3′UTR：3′端非編碼區(qū)；RdRp：依賴于RNA的RNA聚合酶

2.3 HPeV系統(tǒng)進(jìn)化分析及重組分析

基于HPeV全基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，來(lái)自新生兒糞便的HPeV屬于HPeV-1，與其他HPeV-1緊密聚類在一起(圖2A)。用newborn_zjlh不同區(qū)域基因序列進(jìn)行BlastN，結(jié)果顯示P1和P2基因區(qū)與HPeV-1關(guān)系密切，而P3基因區(qū)序列與HPeV-5同源性最高，提示newborn_zjlh可能是基因型間重組的結(jié)果。重組分析結(jié)果證實(shí)newborn_zjlh是HPeV-1 和 HPeV-5基因間重組的結(jié)果(圖2B)。基于不同區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，以P1和P2區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示newborn_zjlh聚集在HPeV-1組中(圖2C、D)，以P3區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示newborn_zjlh與一株HPeV-5密切相關(guān)(圖2E)。為了計(jì)算并驗(yàn)證重組區(qū)域的界限，利用Geneious 11.1.2軟件，將newborn_zjlh全基因組作為參考序列，結(jié)合文庫(kù) newbornfeces41原始序列重新組裝，發(fā)現(xiàn)重疊群覆蓋邊界以及產(chǎn)生的序列(圖3)完全覆蓋newborn_zjlh全基因組，這表明newborn_zjlh毒株重組事件是在新生兒糞便中自然發(fā)生。

2.4 HPeV陽(yáng)性樣本篩查

對(duì)糞便、血液及鼻咽分泌物樣本進(jìn)行巢氏PCR及1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示6份糞便樣本出現(xiàn)目的條帶，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)BlastN驗(yàn)證均為HPeV。HPeV在新生兒消化道感染率為6.3%。

3 討論

目前研究認(rèn)為HPeV是嬰幼兒感染的常見(jiàn)病原。HPeV主要通過(guò)糞便-口腔和呼吸道途徑傳播[12]，常在呼吸道分泌物及糞便樣本中檢測(cè)到該病毒[13]。本研究在95例新生兒糞便中檢出6例HPeV陽(yáng)性(6.3%)，并獲得一個(gè)具有代表性的全基因組，分析顯示其在HPeV-1和HPeV-5基因型間重組。基因重組是導(dǎo)致HPeV遺傳多樣性的一個(gè)常見(jiàn)原因[14]，本研究也證實(shí)這種進(jìn)程在人體可自然發(fā)生。HPeV-1和HPeV-5在世界各地廣泛流行，兒童腹瀉和腸胃炎中檢出率較高[15]。同時(shí)，有臨床研究證實(shí)，HPeV-1和HPeV-5與3歲以下兒童的散發(fā)性癱瘓病例相關(guān)[16]。分析6例HPeV陽(yáng)性新生兒臨床資料，并沒(méi)有腸道感染癥狀及神經(jīng)系統(tǒng)感染證據(jù)。此次鑒定的HPeV毒株的致病性是否與HPeV-1或HPeV-5相同，還有待進(jìn)一步研究。此外，有研究報(bào)道，嬰幼兒早期感染HPeV與其3歲時(shí)的行為問(wèn)題相關(guān)[17]，并在3個(gè)先天性畸形的嬰兒中檢測(cè)出HPeV[18]。因此，應(yīng)觀察并追蹤新生兒期感染HPeV的危害及其與嬰幼兒疾病的相關(guān)性。同時(shí)，對(duì)母嬰合并感染HPeV的情況進(jìn)行研究也是有必要的。

A：基于本研究鑒定的newborn_zjlh和其他具有代表性毒株的全基因組進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析；B：分析newborn_zjlh基因組與相關(guān)毒株基因組的重組結(jié)果；不同的顏色代表推定的重組區(qū)；C、D、E：基于不同重組區(qū)域基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育分析

A：newborn_zjlh全基因組堿基序列與原始序列進(jìn)行組裝后產(chǎn)生的序列；B：newborn_zjlh全基因組堿基序列；C：文庫(kù) newbornfeces41原始序列圖3 HPeV原始序列映射至newborn_zjlh全基因組

本研究獲得一株HPeV毒株基因組，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，它與HPeV-1聚類。重組分析顯示其基因是重組而成，基因組全長(zhǎng)7 207 bp，GC含量39.7%，包含一個(gè)長(zhǎng)度為6 540 bp的ORF。利用ORF在GenBank進(jìn)行BlastP比對(duì)，與其同源性最高的5株 HPeV-1來(lái)自中國(guó)不同地區(qū)(GenBank號(hào)：AID67141、AMR08592、AMR08588、AOT85832、AQX36833)，且均從人體樣本檢出。本研究在調(diào)查血液及呼吸道樣本時(shí)未檢測(cè)出HPeV。已有研究表明，在呼吸道感染性疾病兒童中，HPeV檢出率可達(dá)8.8%[18]。這與本研究結(jié)果差距較大，推測(cè)其可能與新生兒接觸外部環(huán)境時(shí)間及空間受限相關(guān)。

本研究顯示HPeV可在新生兒中流行，而且主要是腸道感染，其危害性尚需進(jìn)一步追蹤觀察。