基于高效液相色譜法的蒙藥制劑薩布如木病洗劑中苦參堿含量測定

閆婧，石曉麗，唐波，寶山，巴乙拉，張冬梅，楊桂娥

（1 包頭市食品藥品檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古 包頭；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特）

0 引言

薩布如木病洗劑為蒙古族驗方，由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院整理并提供。洗劑以苦參、毛冬青、黃柏等9 味藥材，經(jīng)粉碎、水煎、加入芒硝等溶解、混勻制成，為外用的棕色液體。清熱燥濕，殺蟲止癢，養(yǎng)血祛風，活血解毒。用于肛門瘙癢、濕疹、濕疣及其他肛門皮膚疾患，以及痔瘡手術(shù)后，肛門創(chuàng)面恢復(fù)期，創(chuàng)傷而局部的水腫疼痛，創(chuàng)傷面愈合。苦參為方中主藥，性苦、寒，味極苦，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)。具有清熱燥濕，殺蟲，利尿的作用[1]。苦參堿為苦參的有效成分之一，可在機體中發(fā)揮抗氧化、抗過敏、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[2-4]，故建立合理、有效的測定方法對其質(zhì)量進行控制，對提高該制劑的用藥安全具有一定的現(xiàn)實意義。本研究中采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）法測定薩布如木病洗劑苦參中苦參堿的含量。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

1260 Ⅱ高效液相色譜儀（安捷倫公司）；色譜柱:Venusil MP C18：4.6mm×250mm，5μm（博納艾 杰爾）；Ultimate AQ-C18：4.6mm×250mm，5μm（月 旭）；MS205DU 十萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ME204E 萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE 數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

苦參堿（110805-201709），純度：98.7%，購自中國食品藥品檢定研究院。三乙胺、磷酸購自天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；乙腈、甲醇為色譜純（Fisher Scientific），水為超純水；薩布如木病洗劑（內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院），批號分別為20180711，20180938，20180822 規(guī)格：500ml/瓶。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙腈-三乙胺-磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）(10 ∶17 ∶0.1 ∶73)為流動相，流速1ml/min，檢測波長220nm，柱溫30℃，進樣體積20μl。理論板數(shù)按苦參堿峰計算應(yīng)不低于5000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液

取苦參堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg 的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液

取本品混勻，精密量取10ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取3 次，每次15ml 合并提取液，水浴蒸干，殘渣用適量甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻用0.45μm 濾膜過濾，作供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液

按處方比例，制備不含苦參的陰性樣品，再照“2.2.2”項下方法制備成陰性對照溶液，即得。

2.3 專屬性試驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各20μl，按“2.1”色譜條件進行實驗并記錄色譜圖。供試品呈現(xiàn)與對照品保留時間相同的色譜峰，陰性對照在相應(yīng)位置無色譜峰。

2.4 線性范圍

取苦參堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成對照品溶液（64.26μg/ml）；精密量取上述標準對照品溶液配制成濃度為321.3ng/ml、642.6ng/ml、1285.2ng/ml、1927.8ng/ml、2570.4ng/ml、3213.0ng/ml 的標準系列，按上述色譜條件測定，以峰面積對含量進行線性回歸分析，結(jié)果苦參堿在0.3213μg/ml-3.2130μg/ml 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為Y=628.51X-32677，R2=0.9999 結(jié)果表明，苦參堿在濃度為0.3213μg/ml-3.2130μg/ml 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度

取苦參堿對照品（濃度64.26μg/ml），連續(xù)進樣6 次。其RSD 為0.42% (n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性

取同一供試品（20141010）6 份，按供試品制備方法制備樣品，高效液相色譜在220nm 波長處測定峰面積，按外標峰面積計算測定每份樣品的含量，RSD 為0.60%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性

取同一供試品（批號20190913）并制備成供試品溶液后分別于制備 0h、4h、10h、12h、15h、17h、24h 時測定峰面積，結(jié)果見表1。結(jié)果RSD 為1.6% 。表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定。

表1 供試品中苦參堿的峰面積積分值

2.8 樣品回收率

取已知含量的供試品6 份（批號20141010，含量55.62μg/ml），每份分別精密量取5ml 置于分液漏斗中，精密加入苦參堿對照品溶液（0.2142mg/ml）1ml，按照供試品溶液方法制備并測定，記錄色譜圖，計算回收率，平均回收率為100.15%，其RSD 為1.96%，表明該方法準確可靠。

2.9 供試品測定

依據(jù)建立的苦參堿含量測定方法，對3 批薩布如木病洗劑中的苦參堿含量進行考察，其苦參堿含量分別為54.65μg/ml、55.62μg/ml、52.55 μg/ml。

2.10 耐用性試驗

分別用不同廠家型號色譜柱Agela Venusil MP C18、ZORBAXSB-C18、CAPCELL PAK C18，取樣品（批 號20140702）按供試品制備方法制備樣品，測定含量，相對偏差0.1%，表明該方法耐用性較好，方法可行有效。

3 討論

3.1 提取方法

由于苦參堿溶于水，苯，三氯甲烷，乙醚，難溶于石油醚中，本研究考察了三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇（1 ∶1）、三氯甲烷-冰乙酸（4 ∶1）3 種提取溶劑，三氯甲烷提取的苦參堿含量高于三氯甲烷-甲醇（1 ∶1）、三氯甲烷-冰乙酸（4 ∶1），原因可能是三氯甲烷溶劑對樣品的滲透性較好，因而提取率更高。此外還考察了提取次數(shù)的影響，采用三氯甲烷依次為15ml、15ml、15ml 3 次提取后，對樣品第4 次提取的苦參堿進行了考擦，剩余提取液在圖譜相應(yīng)位置無苦參堿峰，結(jié)果表明，在提取次數(shù)為3 次時達到最大提取效率，增加提取次數(shù)苦參堿含量沒有增加。因此選擇提取3 次，每次15ml 三氯甲烷為最優(yōu)提取條件。

3.2 檢測波長的選擇

取苦參堿對照品溶液和樣品提取液在高效液相色譜儀上，用二極管陣列檢測器在190-400nm 全波長掃描，苦參堿在201nm 處有最大吸收，考慮到甲醇和乙腈在200nm處都有干擾，參照《中國藥典》2015 年版一部“苦參”項下含量測定方法，最后確定220nm 為最佳檢測波長。

3.3 轉(zhuǎn)移率及含量范圍

按三批樣品測定苦參堿的平均含量為54.27μg/ml，苦參堿的平均轉(zhuǎn)移率大約在81.34%。考慮生產(chǎn)工藝問題，平均含量乘以平均轉(zhuǎn)移率，結(jié)果再下調(diào)10%計算，暫定為本品含苦參以苦參堿（C15H24N2O）計，不得少于39.0μg/ml。

綜上所述，藥品標準在藥品質(zhì)量監(jiān)管和質(zhì)量控制中均起到十分關(guān)鍵的作用。醫(yī)院制劑品種質(zhì)量標準是制劑配制、質(zhì)量控制的依據(jù)之一[5]。本文建立了蒙藥薩布如木病洗劑中苦參堿的含量測定方法，該方法科學(xué)、簡便、專屬性較強，為促進蒙藥標準化，提高蒙藥發(fā)展水平具有一定的積極意義[6-8]。