pSTAT1與PD-L1在三陰性乳腺癌中的表達及相關性研究

楊宏坤，劉 霞,2，施 琳,2，賈永峰,2，云 芬,2

（1內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010059；2內蒙古醫科大學附屬醫院病理科）

三陰性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和Her2均陰性的一類乳腺癌（breast cancer，BC）亞型。TNBC具有高度異質性和侵襲轉移能力[1]，對常規內分泌治療和化療藥物不敏感，因而預后較差。TNBC具有的高突變率引起免疫原性增加以及更多的免疫細胞浸潤[2]。在正常組織中，信號轉導子和轉錄激活子-1（activator of transcription，STAT1）能傳遞多種細胞因子和生長因子的信號，促進免疫激活、抑制免疫過激，維持機體正常的免疫功能[3]。STAT1具有活性（pSTAT1）與非活性（uSTAT1）兩種狀態，pSTAT1僅在激活后數小時內能被檢測到[4，5]。2-（1，8-萘啶-2-基）苯酚又稱為2-NP，通過促進STAT1 Tyr701（酪氨酸）位點的磷酸化，維持pSTAT1的持續表達[6]。細胞程序性死亡-配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1），是早發現的一個重要免疫檢查點，以PD-L1為免疫檢測指標的腫瘤靶向治療藥物已投入臨床應用，提高腫瘤中PD-L1的表達可以為免疫治療提供有效的靶點[7]。本實驗檢測pSTAT1與PD-L1在TNBC中的表達并探討其相關性，為TNBC的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）標本選取內蒙古醫科大學附屬醫院2017～2019年經病理確診的120例乳腺癌組織，其中50例TNBC組織，70例非non-TNBC組織，收集同期36例乳腺良性病變（腺病）組織，所有病例術前均未經過放化療治療且臨床資料完整；（2）細胞選取MDAMB-468和MCF-7人乳腺癌細胞系，均購于中國醫學科學院，其中MDA-MB-468為TNBC細胞系，MCF-7為non-TNBC細胞系；（3）實驗試劑，抗體使用Phospho-Stat1兔單克隆抗體（Tyr701）（58D6）和PD-L1兔單克隆抗體（E1L3N）XP，均購自Cell Signaling Technology（CST）公司；即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTM SP試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司；2-NP購自上海陶素生物科技有限公司；qRT-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術（TransGen Biotech）有限公司；引物購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 方法

免疫組化采用EnVision法，經過脫蠟，抗原修復，3%雙氧水封閉，山羊血清封閉，一抗孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木素染色，脫水透明，封片；操作過程嚴格按照產品說明書進行；pSTAT1使用EDTA微波熱修復，抗體稀釋比例為1：800；PD-L1使用檸檬酸微波熱修復，抗體稀釋比例為1：200。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR），使用DMEM基礎培養基、滅活胎牛血清（FBS），按9：1的比例配制成完全培養基，于一定濕度的37℃恒溫二氧化碳培養箱中常規培養MCF-7和MDA-MB-468細胞，當細胞長至培養瓶85%～90%，并且細胞狀態良好時，對照組經2-NP（45uM）處理一小時后，提取對照組與正常對照組（DMSO組）中的RNA，反轉錄合成cDNA，采用qRT-PCR檢測MCF-7、MDA-MB-468細胞系處理組與對照組中PD-L1和IRF-1的相對表達量。所用引物序列：PD-L1：F-TGGCATTTGCTGAACGCATT、R-TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT，IRF-1：F-CGGGGCTCATCTGGATTAATAA、R-GGTCTTTCACCTCCTCGATATC，β2MG（內 參）：F-TGTTGCCATCAATGACCCCTT、R-CTCCACGACGTACTCAGCG

1.3 結果判定

乳腺癌組織中，pSTAT1表達于癌細胞以及免疫細胞的細胞核中，部分細胞質伴有少量表達，以癌細胞核陽性作為判讀指標；PD-L1表達于癌細胞以及免疫細胞的細胞膜和細胞質中，以癌細胞膜陽性作為判讀指標。乳腺腺病中，以腺上皮細胞核（pSTAT1）或細胞膜（PD-L1）陽性為陽性指標。

免疫組化采用腫瘤細胞陽性比例分數（tumor proportion score，TPS）打分，隨機選取10個高倍鏡視野（×400），每個視野最少計數100個腫瘤細胞，然后計算每個高倍視野中陽性細胞的百分比，再算出10個視野的平均百分率，以TPS≥1%為陽性，0

1.4 統計學分析

實驗數據使用SPSS 22.0統計軟件進行分析，比較采用χ2檢驗、Spearman相關性分析、方差分析以及Fisher確切概率法進行數據分析，檢驗水準為α=0.05，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pSTAT1與PD-L1在TNBC組織中的表達

2.1.1pSTAT1在乳腺癌中的表達（見圖1）根據TPS打分標準，BC陽性率為27.5%，TNBC陽性率為44%，non-TNBC陽性率15.7%，乳腺腺病不表達pSTAT1，陽性率為0（pSTAT1在腺上皮細胞中不表達，肌上皮細胞鮮有表達，以腺上皮細胞核陽性為判讀標準）；與non-TNBC相比TNBC表達水平顯著升高，且具有統計學差異（χ2=11.7，P=0.001<0.05）（見表1）。

表1 pSTAT1在乳腺癌和乳腺腺病組織中的表達情況Tab.1 TheexpressionofpSTAT1inbreastcancerandbenigntissues

2.1.2在TNBC中pSTAT1陽性病例具有多種特殊表達模式（1）陽性腫瘤細胞以點灶狀分散在癌巢中（見圖1A）占總陽性病例數40.9%；（2）陽性腫瘤細胞集中在腫瘤巢團與間質交界處（見圖1B）占總陽性病例數27.3%；（3）部分病例中可觀察到癌巢呈彌漫表達（見圖1C），占總陽性病例數18.2%；（4）而較少的病例中可出現點灶和交界模式混合表達，占總陽性病例數13.6%（見圖1D、表2），以上四種模式可以概括為，散在點灶狀分布、癌巢邊緣分布、彌漫表達和混合表達。

圖1 pSTAT1在乳腺癌中的表達Fig.1 The expression of pSTAT1 in breast cancer

表2 pSTAT1在乳腺癌中的表達模式及其比例分布Tab.2 Theexpressionpatternandproportiondistributionof pSTAT1inbreastcancer

2.1.3PD-L1在乳腺癌中的表達（見圖2A）結果判讀采用TPS打分標準，120例乳腺癌陽性率為9.23%，TNBC陽性率為22.0%，non-TNBC陽性率為2.9%，36例乳腺腺病陽性率為0（以腺上皮細胞膜陽性為判讀標準）；PD-L1在TNBC和non-TNBC中的表達差異具有統計學意義（χ2=7.41，P=0.001<0.05）（見表3）。

圖2 PD-L1在乳腺癌中的表達Fig.2 Expression of PD-L1 in breast cancer

表3 PD-L1在乳腺浸潤性癌和乳腺腺病組織中的表達情況Tab.3 TheexpressionofPD-L1inbreastinvasivecarcinomaand benignlesions

2.1.4pSTAT1與PD-L1表達的相關性分析TNBC中pSTAT1與PD-L1表達位置相似，二者可能存在共表達（見圖3）；通過統計學分析，pSTAT1與PDL1的表達具有相關性（r=0.507，P<0.05）（見表4）。

圖3 乳腺癌中PD-L1和pSTAT1的表達Fig.3 The expression of PD-L1 and pSTAT1 in breast cancer

表4 pSTAT1與PD-L1表達的相關性分析Tab.4 CorrelationanalysisofpSTAT1andPD-L1positive expression

2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測IRF-1和PD-L1的相對表量

經qRT-PCR檢測結果顯示，MCF-7、MDAMB-468的處理組中PD-L1的相對表達量均高于對照組，MDA-MB-468處理組中PD-L1的表達量為對照組的4.234倍，具有統計學差異（P<0.05）；MCF-7處理組中PD-L1的表達量為對照組的2.75倍，具有統計學差異（P<0.05）；MDA-MB-468中IRF-1的表達量為對照組的6.682倍，具有統計學差異（P<0.05）；MCF-7中IRF-1的表達量為對照組的1.171倍，處理組與對照組相比不具有統計學差異（P>0.05）；MDA-MB-468較MCF-7中IRF-1和PD-L1的表達量增高的更為顯著（見表5、圖4）。

表5 IRF-1和PD-L1的相對表達量Tab.5 RelativeexpressionlevelsofIRF-1andPD-L1

圖4 IRF-1和PD-L1的相對表達量Fig.4 Relative expression of IRF-1 and PD-L1

3 討論

早在1902年，STAT1就開始被關注和研究。STAT1除具有激活機體抗炎、抗腫瘤免疫反應外，與腫瘤的生長、轉移等密切相關[8～10]，如腎癌、肺腺癌以及胰腺癌中，高表達的STAT1與患者的生存期（overall survival，OS）低有關，特別是在腎癌中STAT1表達的增加與高級別、晚期、體積較大的腫瘤、淋巴結轉移和遠處轉移有關[9]。與STAT1表達低或不表達的乳腺癌患者相比，高表達STAT1的患者預后更差[6]，STAT1在腫瘤中的功能并非始終處于良性端。通常情況下，STAT1以非活性（uSTAT1）的無功能形式存在，僅在激活后數小時內以活性（pSTAT1）狀態存在并發揮其傳導和轉錄功能[4]。目前，活性狀態的pSTAT1在TNBC中的研究較少，其功能和意義尚無明確解釋。

本研究中發現，pSTAT1在TNBC中存在特異性激活，并且具有四種不同的表達模式，pSTAT1高表達的腫瘤細胞周圍常伴有較多的免疫細胞，推測腫瘤細胞中pSTAT1的表達可能是受到相鄰免疫細胞的激活。STAT1的活化受到IFN-γ等細胞因子的作用，而激活的免疫細胞分泌大量的細胞因子[8]。通過以上分析發現，pSTAT1的表達模式可能反應了腫瘤中免疫細胞浸潤的程度。（1）點灶狀，表現為pSTAT1陽性的腫瘤細胞呈片狀或小灶狀表達于腫瘤巢團內；可能是由于少量的免疫細胞分散浸潤于癌巢中，相鄰腫瘤細胞受到激活持續表達pSTAT1（見圖1A）；（2）癌巢邊緣表達模式，表現為pSTAT1高表達在癌巢與間質交界處的的腫瘤細胞中，這一類型的癌巢周邊常伴有較多的免疫細胞浸潤，但免疫細胞很少侵入癌巢中（見圖1B），推測免疫細胞分布在癌巢周圍，因此刺激腫瘤邊緣細胞高表達pSTAT1；（3）彌漫表達，推測是由于大量的免疫細胞浸潤于癌巢中，引起pSTAT1彌漫表達（見圖1C）；（4）混合表達，癌巢邊緣與點灶狀模式同時表達，可能是由于免疫細胞包圍并浸潤到癌巢中，激活相鄰腫瘤細胞高表達pSTAT1（見圖1C）。

既往研究表明，PD-L1抑制T細胞功能，傳導免疫抑制信號，是腫瘤免疫逃逸的關鍵機制之一[11]。本研究中發現，與non-TNBC相比，TNBC中高表達PD-L1，PD-L1的高表達可能協助TNBC免受微環境中的免疫攻擊和控制。對比發現，pSTAT1與PDL1在TNBC中的表達分布一致，二者可能存在共表達（見圖3）；通過統計學分析，pSTAT1與PD-L1的表達具有相關性（P<0.05）。

為了進一步證實二者的相關性，我們使用STAT1激活劑2-NP處理人乳腺癌細胞系MDAMB-468和MCF-7，觀察PD-L1和IRF-1的表達。由于2-NP對核因子（NF）κB、STAT3無作用，因此對STAT1具有特異性[12，13]。結果顯示，與對照組相比，2-NP處理后兩種細胞系中的PD-L1表達均上調，證實乳腺癌中pSTAT1與PD-L1具有正相關性。MCF-7中處理組IRF-1表達量高于對照組，但差異不具有統計學意義，MDA-MB-468較MCF-7中IRF-1和PD-L1的表達量增高的更為顯著（見圖4），提示TNBC中pSTAT1高表達可能會誘導STAT1-IRF1-PDL1通路的激活；而non-TNBC中pSTAT1與PD-L1雖具有正相關性，但可能尚存在其他通路。已有最新實驗證實，在惡性黑色素瘤及卵巢癌中存在STAT1-IRF1-PDL1通路級聯激活，誘導免疫檢查點配體PD-L1的高表達[14，15]。STAT1作為機體下放免疫信號的重要調節因子，不僅能夠激活免疫系統，在炎癥后期通過限制免疫反應，避免免疫過激也起到重要作用，STAT1相關的炎癥級聯反應是調節這一免疫平衡的關鍵[4]。TNBC可能利用STAT1的免疫調節能力，持續性高表達pSTAT1，進而上調PD-L1的表達，協助腫瘤逃避免疫系統的識別與攻擊，最終產生免疫逃逸。這或許能夠在某種程度上解釋適應性免疫系統不能識別和破壞高免疫原性腫瘤細胞的原因。

綜 上 所 述，pSTAT1和PD-L1在TNBC中 高 表達，pSTAT1促進了PD-L1在TNBC中表達，pSTAT1有望成為TNBC免疫治療的重要靶標，為TNBC臨床治療提供新的策略。