響應面法優化硬毛棘豆總黃酮的提取工藝

劉 洋，丁艷霞，岳 鑫，王曉琴

（內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010059）

硬毛棘豆（oxytropishirta bunge）為豆科多年生草本植物，又名毛棘豆[1]，地上部分入蒙藥，為“達克沙”正品藥材[2]，與多葉棘豆功效相同，能殺“粘”，消熱，燥“黃水”，生肌，止血，消腫，通便，用于瘟疫，吐血，咳痰[3]。棘豆屬多種植物的民間用藥歷史悠久，多見于蒙藥、藏藥以及一些草藥典籍收載；國內外學者對其中的20余種藥用植物已經進行了深入的研究報道，表明本屬的特征性成分為黃酮類、三萜類和生物堿類成分，且已從這個屬分離得到了100多個黃酮類成分[4~6]。目前，硬毛棘豆還沒有系統的化學成分研究，藥理學研究尚空白。課題組前期對硬毛棘豆的植化研究表明其富含黃酮類化合物，本研究首次采用響應面法優化了硬毛棘豆中總黃酮的提取工藝，并測定不同產地硬毛棘豆的總黃酮的方法，以期為硬毛棘豆藥效物質基礎的研究和進一步開發利用提供參考依據。

1 儀器與材料

AL-204型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），UV-1280型紫外可見分光光度計（日本島津）。

實驗用的9批藥材均為2017-08~2018-08采集于硬毛棘豆的主產地內蒙古赤峰市周邊地區；蘆丁標準品購買于中國藥品生物制品檢定所，批號0080-9705；實驗用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

取干燥至恒重的蘆丁標準品5 mg，精密稱定，配制成50 μg·mL-1的對照品溶液，貯藏于4℃冰箱備用。

2.2 供試品溶液的制備

取干燥的藥材粉末（過80目篩）0.2 g，精密稱定，加入70%乙醇25 mL，超聲60 min，搖勻并過濾，取續濾液即得。

2.3 吸收波長的確定

吸取對照品溶液3 mL和供試品溶液2 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入1 mL的1%AlCl3甲醇溶液，用甲醇定容，靜置15 min。以顯色劑為空白，在200~800 nm波長范圍內進行全波長掃描，結果顯示供試品溶液與對照品溶液在275 nm處均有最大吸收，且干擾較小，故選擇275 nm作為測定波長（見圖1）。

圖1 蘆丁對照品溶液（A）和供試品溶液（B）的吸收波長掃描

2.4 方法學考察

2.4.1標準曲線的繪制 精密量取蘆丁對照品溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0 mL分別置于10 mL量瓶中，按“2.3”項下的方法顯色后，以顯色劑為空白，測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，濃度（μg·mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線，計算得到回歸方程Y=0.0446 X+0.015（r=0.9993）。結果表明，蘆丁在2.5~15.0 μg·mL-1的濃度范圍內與A值呈良好的線性關系。

2.4.2精密度試驗取硬毛棘豆藥材粉末，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的方法顯色后，在275 nm處測定吸光度A，重復6次，結果A分 別 為0.7556、0.7551、0.7555、0.7558、0.7553、0.7550，A值的RSD為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩定性試驗取硬毛棘豆藥材粉末，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，分別于0h、2h、4h、8h、12h、24 h后顯色，在275 nm處測定吸光度A。按“2.4.1”項下計算總黃酮的含量分別為20.89mg·g-1、20.83mg·g-1、20.85mg·g-1、21.00mg·g-1、21.05mg·g-1、21.09 mg·g-1，RSD為0.52%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.4重復性試驗 取硬毛棘豆藥材粉末，按“2.2”項下的方法平行制備供試品溶液6份，分別精密量取1 mL供試品溶液于10 mL量瓶中，顯色后，在275 nm處測定吸光度A，按“2.4.1”項下計算總黃酮的平均含量為20.49 mg·g-1，RSD為0.35%，表明本實驗采用的方法重復性良好。

2.4.5加樣回收率試驗 取已知含量的硬毛棘豆藥材粉末約0.1 g，精密稱定，平行稱定9份，分別精密加入相當于藥材中總黃酮含量的80 %，100 %，120%倍量的對照品溶液，平行測定3份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，顯色后，以顯色劑為空白，在275 nm處測定吸光度A。計算加樣回收率及RSD，表明該方法準確度良好（見表1）。

表1 加樣回收率試驗結果

2.5 總黃酮提取工藝單因素實驗

2.5.1提取方法的考察 取藥材粉末約0.2 g，精密稱定4份（n=2），兩份分別置于50 mL圓底燒瓶中，用25 mL 70%乙醇浸泡30min，加熱回流提取30 min，冷卻，補足減失重量，搖勻并過濾。另兩份分別置于50 mL具塞錐形瓶中，用25 mL 70%乙醇浸泡30min，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，補足減失重量，搖勻并過濾。計算總黃酮含量分別為17.42mg·g-1、16.98 mg·g-1。由結果可知，兩種提取方法測得含量相差不大，考慮操作簡便快捷，確定提取方法為超聲提取。

2.5.2提取溶劑的考察 取藥材粉末約0.2 g，精密稱定18份（n=2）于50 mL具塞錐形瓶中，分別以水、30%、50%、70%、100%的甲醇以及30%、50%、70%、100%的乙醇各25 mL為提取溶劑，超聲提取30min，結果可知70%乙醇提取的總黃酮含量最高。

2.5.3超聲時間的篩選 取藥材粉末約0.2 g，精密稱定12份（n=2），分別超聲提取20min、30min、40min、50min、60min、90 min，其余方法相同。結果顯示超聲提取時間選擇60 min為宜。

2.5.4取樣量的篩選分別取藥材粉末約0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5 g，精密稱定10份（n=2），超聲提取60 min，其余方法相同。結果表明，當取樣量約為0.2 g時，提取率保持在20.50mg·g-1，因此選擇0.2 g作為取樣量。單因素試驗得出硬毛棘豆中總黃酮的最佳提取條件為取樣量0.2 g，加70%乙醇25 mL，超聲提取60 min。

2.6 響應面優化設計

2.6.1試驗設計 選擇影響提取工藝的因素乙醇濃度（A）、提取時間（B）、取樣量（C），根據Boxbehnken試驗設計原理，設計三因素三水平試驗，因素及水平編碼表（見表2）。

表2 響應面試驗因素水平編碼表

2.6.2試驗結果 依Box-Behnken試驗設計17組，進行試驗，計算總黃酮的含量（見表3）。

表3 提取條件(A，B，C)對總黃酮含量(Y)的Box-Behnken試驗設計及結果

2.6.3回歸模型方程的建立及顯著性檢驗通過Design-Expert 10.0.7軟件對表3數據分析并進行回歸擬合，得到試驗實際值的二次回歸模型方程：Y=-29.25950+0.97740A+0.50158B+12.60250C+1.47500×10-3AB+0.11250AC-0.055000BC-7.93500×10-3A2-4.86000×10-3B2-41.60000C2。方程模型的相關系數（R2=0.9893，P＜0.0001），說明模型達到極顯著（見表4）。同時，離散系數較小，為0.46%。模型失擬項（P=0.2328＞0.05），表明失擬不顯著，回歸方程與實際情況擬合很好。乙醇濃度二次項（A2）、超聲時間二次項（B2）、取樣量二次項（C2）對硬毛棘豆中總黃酮含量的影響極顯著（P＜0.01）；超聲時間（B）、乙醇濃度與超聲時間交互項（AB）、乙醇濃度與取樣量交互項（AC）對硬毛棘豆中總黃酮含量的影響顯著（P＜0.05），說明改變這些因素水平會對響應值產生較大的影響。根據表中F值可知，一次項中對總黃酮含量影響程度主次的因素為：乙醇濃度>提取時間>取樣量。

表4 提取條件(A，B，C)對總黃酮含量的回歸模型方差分析結果

2.6.4響應面分析 根據上述回歸模型得到對應的響應曲面圖（見圖2）。當固定因素取0水平對應的值時，總黃酮的含量隨乙醇濃度、超聲時間和取樣量的增大均呈現先增后降的趨勢，響應面圖向上凸出，說明3個因素在所選水平范圍內均能產生最佳的響應值。乙醇濃度（A）和提取時間（B）的交互作用及乙醇濃度（A）和取樣量（C）的交互作用對硬毛棘豆中總黃酮含量的影響顯著，表現為圖2Ⅰ、2Ⅱ的等高線圖呈橢圓形，而提取時間（B）和取樣量（C）的交互作用對總黃酮含量的影響不顯著，表現為圖2Ш的等高線圖接近于圓形。以上結果與表4數據結果一致。

圖2 乙醇濃度(A)、提取時間(B)和取樣量(C)之間交互作用對總黃酮含量的影響

2.6.5驗證實驗Design-Expert 10.0.7軟件分析獲得硬毛棘豆中總黃酮提取的最佳條件為：乙醇濃度為69.5%，超聲時間為60.8 min，取樣量為0.2 g，在此最佳提取條件下進行3次驗證試驗（見表5）。試驗結果與預測相符，說明運用響應面進行分析的數據可靠性強。

表5 最佳提取條件獲得總黃酮含量的預測值與實際值對比

2.7 硬毛棘豆總黃酮的含量測定

取9批硬毛棘豆藥材樣品約0.2 g，平行3份，精密稱定，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的方法顯色后，以顯色劑為空白，在275 nm處測定吸光度A，計算總黃酮的含量（見表6）。

表6 樣品含量測定結果（n=3）

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3 結語

Al（NO3）-NaNO2-NaOH比色法、AgCl3比色法、三乙胺顯色法、氫氧化鉀顯色法等是最為常用的測定中藥中總黃酮的方法[7~10]。本研究分別對上述4種方法進行了比較，結果供試品溶液在AgCl3顯色法顯色后最大吸收峰較為明顯，所以將AgCl3顯色法定為測定硬毛棘豆總黃酮含量的顯色方法，并進行了方法學驗證，測定了9批野外采集的硬毛棘豆藥材的總黃酮含量。

本實驗在單因素試驗基礎上，運用響應面設計對提取工藝進行進一步優化。以硬毛棘豆中總黃酮含量為指標，通過Box-Behnken響應面設計并進行分析，得出硬毛棘豆中總黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度69.5%，超聲時間60.8 min，取樣量0.20 g，結合實際操作，得到最佳條件下總黃酮含量為（20.84±0.07）mg·g-1，與預測結果相似，證明響應曲面法所構建的模型可靠[11]。實驗結果為硬毛棘豆中總黃酮的開發利用提供了參考依據，響應面法優化提取工藝具有一定的指導意義。