脂多糖與益生菌對膽總管結石形成的影響

牛昊書，崔 宏，陳 吉，侯羽菲

（1.內蒙古包鋼醫院消化內科，內蒙古 包頭 014010；2.青島西海岸區人民醫院消化內科）

膽系結石疾病在我國是一種常見病，對公共衛生系統造成了巨大的醫療負擔。大多數膽囊結石均在膽囊中發現，但有時會通過膽囊管進入肝外膽管，成為膽管結石，約有10%~15%的膽結石患者伴有膽管結石。膽管結石也可在沒有膽囊結石的情況下形成，這種由膽色素為主要成分的原發性膽管結石在東亞國家比歐洲國家更為常見[1]。膽系結石形成的原因有很多，其中微生物菌群在膽系結石形成中的促進作用逐漸得到了證實，但具體發病機制仍然不十分清楚。幾年前，人們已經認識到，膽道在非病理條件下具有復雜的微生物群。腸道菌群可通過奧狄括約肌或經腸肝循環通過血液進入肝臟進而通過膽汁分泌定植于膽道內[2]。通過影響膽固醇和膽汁酸的代謝和分泌促進膽色素結石和膽固醇膽石的形成[3，4]。脂多糖/內毒素（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，近年研究發現內毒素可通過多種途徑促進膽系結石的形成[5]。薈萃分析顯示，益生菌（嗜酸乳桿菌，乳酸桿菌，植物乳桿菌組）可以顯著降低血清總膽固醇[6]，有研究發現膽道結石患者膽汁中雙歧桿菌的比例明顯下降[7]，提示益生菌治療有可能作為預防膽道結石形成的手段之一。本研究通過檢測膽總管結石病人口服腸道益生菌前后膽汁的LPS濃度變化進行研究，探討LPS及腸道益生菌在膽總管結石形成過程中的作用，以期為膽總管結石形成的預防提供參考思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取在2016-12~2020-10就診于我院的巨大或復雜膽總管結石（單發結石直徑≥20mm，或多發結石且其中最大結石直徑≥20mm）患者，選取行ERCP無法一次完全取石留置膽管塑料支架患者45例為A組，男24例，女21例，平均年齡（70.09±13.53）歲，均于6月后復行ERCP更換支架或再次取石，首次ERCP術后隨機選取15例口服雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片4片/次，一日3次6月為A1組，男6例，女9例，平均年齡（71.4±11.49）歲，余30例為A2組，男18例，女12例，平均年齡（69.43±14.58）歲；選取行ERCP檢查的無膽管結石的膽管惡性狹窄患者26例為B組，男14例，女12例，平均年齡（72.73±12.07）歲，其中行膽總管金屬支架置入術12例，其中術后口服雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片4片/次，一日3次6月6例為B1組，平均年齡（77.33±9.05）歲，余6例膽總管金屬支架置入術未口服雙歧桿菌乳桿菌為B2組，平均年齡（78.33±10.82）歲。余14例為臨時置放塑料支架后短期內行手術治療。納入標準：采用B超、CT或MRCP診斷明確；排除標準：（1）發熱患者；（2）患有免疫系統疾病、慢性肝病、慢性呼吸系統疾病、慢性腎臟疾病、其他系統急慢性感染癥狀、術前使用抗生素的患者。本研究已通過醫院倫理委員會批準，每位手術者均簽署知情同意書。

1.2 標本采集

A組及B組均行ERCP術，A組予膽總管取石術及膽總管塑料支架置入術，6月后復行ERCP膽總管塑料支架拔出術或膽總管取石術，ERCP術中造影導管成功超選插入膽總管后，用無熱原注射器接造影導管抽取膽汁3~5mL，用于脂多糖檢測。

1.3 檢測方法

膽汁中脂多糖的檢測采用顯色基質定量法，試劑為購自丹娜（天津）生物科技有限公司的革蘭氏陰性菌脂多糖檢測試劑盒，檢測按照試劑說明進行。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 脂多糖變化

脂多糖在A組（膽總管結石組）膽汁中濃度為（19.36±5.23）EU/mL，高于B組（膽管狹窄組）膽汁中的濃度（9.32±4.48）EU/mL，差異有統計學意義（t=8.19，P<0.05）（見表1）；置入支架前，A1組（口服益生菌組）膽汁中的脂多糖濃度為（19.98±5.98）EU/mL，A2組（未口服益生菌組）膽汁中脂多糖濃度為（19.04±4.90）EU/mL，差異無統計學意義（t=0.56，P>0.05），6月后，A1組（口服益生菌組）中的脂多糖濃度為（10.18±2.28）EU/mL，較前顯著降低（t=6.96，P<0.05）。A2組脂多糖濃度為18.71±4.23 EU/mL，較前雖輕微降低，但差異無統計學意義（t=0.85，P>0.05）。A1組脂多糖濃度顯著低于A2組，差異有統計學意義（t=-7.27，P<0.05）（見表2）。

表1 膽管結石組與狹窄組LPS濃度（EU/mL）比較

表2 膽管結石組置入支架前后LPS濃度（EU/mL）比較

2.2 結石大小變化

置入支架前A1組結石直徑（22.25±2.96）mm，A2組結石直徑（22.10±2.38）mm，差異無統計學意義（t=0.20，P>0.05）；置入支架6月后，A1組結石平均直徑（19.6±4.14）mm，較置放支架前明顯縮小（t=3.42，P<0.05），A2組結石平均直徑（20.07±4.07），較置放支架前明顯縮小（t=3.27，P<0.05），雖支架6月后A1較A2組結石平均直徑小，但差異無顯著統計學意義（t=-0.36，P>0.05）（見表3），總的結石縮小率（有結石縮小證據的病人數占所在組總人數的比率）A1組為66.7%、A2組為53.3%，但差異無統計學意義（χ2=0.73，P>0.05）（見表4）；根據結石的數量與大小制定簡易評分（見表5），置入支架術后6月，B1組（1.67±1.37）分低于B2組（2.67±1.50）分，但差異無統計學意義（t=1.20，P>0.05）（見表6）。

表3 膽管結石組置入支架前后結石直徑（mm）比較

表4 總的結石縮小率比較

表5 膽總管結石簡易評分

表6 膽管狹窄組支架后產生結石評分比較

2.3 結石大小與脂多糖的相關性

LPS濃度與A組置放支架前結石大小呈正相關（r=0.881，P<0.05），線性回歸分析（R2=0.776，P<0.05）；LPS與A組置放支架6月后結石大小亦呈正相關（r=0.962，P<0.05），線性回歸分析（R2=0.925，P<0.05）（見圖1、2）。A1組脂多糖濃度降低幅度（9.80±5.45）EU/mL與結石減小程度（2.67±5.04）mm無明顯相關性（r=0.281，P>0.05）。

圖1 LPS濃度與A組置放支架前結石大小關系

圖2 LPS濃度與A組置放支架6月后結石大小關系

3 討論

近年臨床研究證實，膽道感染是膽管結石形成的主要原因之一[2]，通常，從十二指腸腸道細菌的逆行感染被認為是膽系感染的可能主要來源。此外，當腸道膽鹽缺乏、小腸黏膜屏障損傷時，細菌通過門靜脈系統入侵也有助于膽道感染。肝膽管結石患者膽汁中含有大量革蘭氏陰性桿菌，其產生的LPS含量與感染的程度呈正相關。

大量研究表明，LPS與膽系結石的形成具有密切關系。Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）可通過多種分子模式刺激免疫應答，并通過獲得性免疫對機體進行保護[8]，但這些應答導致的持續性炎癥反應會對機體產生損傷。研究發現哺乳動物膽管上皮細胞有TLR4表達。LPS是TLR4的天然配體，其可通過激活TLR4信號通路，從如下方面[9]引起膽管結石的產生：（1）LPS與枯否細胞（kupffer cells，KCs）細胞膜表面CD14的結合，通過激活LPS/TLR4信號通路從而介導了KCs合成和分泌多種促炎因子，引起持續性炎性損傷；（2）LPS/TLR4誘導產生某些炎癥介質和細胞因子，激活細胞內MAPKs-NF-κB信號通路，致使產生炎癥的瀑布效應，導致自由基產生，氧、羥自由基增加會加速膽道內膽紅素鈣結石生成，沉淀顆粒增大，進而形成肝膽結石；（3）LPS/TLR信號通路通過參與膽囊炎癥的發生和發展，導致膽囊功能受到影響，引起肝內膽管膽汁淤積，從而形成肝膽管膽石；（4）唐世芳等[10]通過用LPS刺激人膽管上皮細胞株進行培養發現TLR4參與活化并激活由LPS介導的肝內膽管上皮細胞發生上皮-間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），參與肝膽管纖維化的進程，改變膽管樹內膽汁流，影響結石的形成；（5）LPS可以使組織源性β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidas，β-GD）的合成和釋放增加，分解膽紅素雙葡糖醛酸酯，使結合膽紅素分解成游離膽紅素，進而與鈣結合生成膽紅素鈣結石，對無細菌感染的膽色素結石的產生起到一定作用。

本研究發現膽管結石組膽汁內LPS含量明顯高于無結石的膽總管狹窄組（P<0.01），且LPS濃度與結石大小呈正相關性（P<0.01），線性回歸分析提示膽總管結石大小變化可以用LPS濃度為解釋變量的線性回歸模型來解釋（P<0.01），提示LPS可能為膽管結石的原因之一，這與目前的研究相符。但LPS與膽管結石的形成原因互為雙向性，究竟LPS是膽管結石形成的原因，亦或LPS增多繼發于膽總管結石的形成，尚需進一步行動物研究以明確。本研究通過對ERCP膽管金屬支架置入術前無結石的膽管惡性梗阻的觀察發現，通過口服益生菌抑制LPS濃度的B1組繼發結石的評分低于B2組，雖統計學差異不明顯（P>0.05），考慮與樣本量低，觀察時間短有關，但仍有可能提示抑制LPS濃度可減少或預防結石的可能，需增加樣本量及觀察時間以明確。本研究發現，A1組6月后LPS濃度顯著降低（P<0.01），6月后A1與A2組結石直徑較前均明顯減小（P<0.01），但A1組與A2組結石直徑無明顯差異（P>0.05），且A1組脂多糖濃度降低幅度與結石減小程度無明顯相關性（P>0.05），提示LPS有促進結石形成的作用，但對已形成的膽管結石，依靠單純減低LPS濃度并不能起到減小結石的作用，通過減少LPS濃度可能起到預防膽管結石，而非治療的效果。

近十年來，許多基于人類和動物模型研究證實胃腸道不同部位微生物菌群與膽系結石的形成存在聯系，膽道的微生物組與十二指腸的微生物群具有高度相似性[11，12]。參與膽汁酸氧化和差向異構化的腸道細菌會破壞膽汁酸的腸肝循環并導致膽系結石的形成[2]。膽汁成分（即膽固醇或膽紅素）的失衡是導致膽道內結石形成的主要機制。結石通常分為3種類型：膽固醇結石，黑色色素結石和褐色色素結石。膽固醇和黑色色素結石通常在膽囊內形成，它們的形成在很大程度上取決于宿主脂質穩態和膽紅素代謝。相反，褐色色素結石與膽道感染有關，通常在膽管內形成[13]。在東亞，原發于膽總管的結石比在西方更為常見，基于生化結構差異，膽固醇結石在膽囊結石中的比例為58.3%，而在膽總管結石中的比例為31.1%，膽色素結石在膽囊結石中的比例為39.6%（黑色素結石23.7%、褐色素結石15.9%），在膽總管結石中的比例為66.1%（黑色素結石11.8%、褐色素結石54.3%），褐色素結石比黑色素結石膽固醇含量更高，褐色素結石及膽固醇結石中均存在細菌，表明細菌感染在以膽固醇為主的結石形成中起著致病作用[1]。

厭氧菌（最常見的是大腸桿菌）會產生多種酶，例如綴合的膽汁酸水解酶，這些酶會化學修飾膽管內的膽紅素。在此過程中，膽紅素被細菌β-葡萄糖醛酸糖苷酶水解為未結合的膽紅素，其迅速沉淀，與膽管樹中的鈣結合，導致結石形成[13]。Ye等[12]發現三個腸桿菌科（大腸埃希氏菌，克雷伯菌和未分類屬）和椎體桿菌屬在膽總管結石病人膽汁中高度豐富，Wu等[14]發現膽結石患者和健康受試者之間腸道微生物成分有著顯著的變化，膽結石患者存在著細菌門蛋白質細菌的過度生長，通常包括多種病原體，如大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌和螺旋桿菌等。

膽汁酸和腸道菌群之間的關系是緊密而互補的。膽汁酸控制腸道細菌的過度生長并防止炎癥，而腸道菌群則在膽汁酸的生物轉化中發揮作用，并通過末端回腸的法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）和G蛋白偶聯的膜受體5（G protein-coupled membrane receptor 5，TGR5）在肝臟中影響膽汁酸的組成和代謝[15]。腸道細菌通過BSH將初級膽汁酸解偶聯為游離膽汁酸，然后通過7α-脫羥基作用將游離膽汁酸轉化為次級膽汁酸，肝腸循環中游離膽汁酸和次級膽汁酸的增加，可能導致免疫細胞功能性FXR的抑制，進而引起膽汁膽固醇過飽和并誘導膽固醇結石形成。Berr等表明，次級膽汁酸的增加促進膽固醇結石的形成。研究發現，患有GSD的患者中7α-脫羥基細菌的水平比沒有GSD的患者高42倍（P<0.01）。

雙歧桿菌對致病性大腸埃希菌、福氏志賀菌、沙門菌等腸道致病菌有拮抗作用，可抑制產生內毒素的革蘭氏陰性菌數量，并有降膽固醇的作用。Liang[7]等發現在膽管Oddi括約肌松弛下，雙歧桿菌和李斯特菌的比例急劇下降，提示雙歧桿菌有潛在的作為預防膽總管結石治療方案的可能。

本研究發現，長期口服雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片的膽管塑料支架置入組患者的膽汁LPS較口服前及未口服組均顯著減少（P<0.01），提示雙歧桿菌可有效抑制膽道革蘭氏陰性菌感染。相關研究表明，膽管塑料支架置入術后，可使患者結石的大小及數量減少。本研究發現，置入膽總管塑料支架的膽總管結石病人中，口服益生菌組的膽總管結石平均直徑較未口服組減小不顯著（P>0.05），提示雙歧桿菌對已經形成的膽總管結石無明顯縮小作用。雖總的結石縮小率更高，但差異亦無明顯統計學意義（P>0.05），需進一步行動物研究以了解口服益生菌對已形成結石的影響。膽管惡性狹窄患者均置放直徑為1cm的金屬裸支架，長期口服雙歧桿菌組繼發膽總管結石評分低于未口服組，提示口服雙歧桿菌可能對膽總管結石的形成有抑制和預防的作用，但差異無明顯統計學意義（P>0.05），考慮與樣本量較小及觀察時間較短有關，另外膽管癌患者身體狀況不一、膽道狹窄程度及損傷程度不一，均對結果產生影響，益生菌對結石的抑制和預防作用有待更嚴格的篩選標準及更大的樣本量研究或動物模型研究以明確其作用。

脂多糖增高可能為膽總管結石形成原因之一，通過抑制LPS/TLR4信號通路有可能對預防或抑制膽總管結石的形成產生積極影響?？诜嫔烧{節腸道菌群及膽道菌群，減少膽道內脂多糖水平，可能對膽總管結石的形成起到一定預防及抑制作用，具體機制及效果有待深入研究。