IL-36s在掌跖膿皰病中的作用的研究

李 娜，李東霞，王媚媚，呂新翔

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

掌跖膿皰病（palmoplantar pustulosis，PPP）是屬于皮膚炎癥性疾病中較為多見的一種，疾病特點(diǎn)病程時(shí)間長(zhǎng)，易反復(fù)發(fā)作，難完全治愈。PPP的病變特征主要存在于掌跖部位，紅斑泛發(fā)，伴隨無間斷發(fā)作的水皰和膿皰，角化及苔蘚樣變、及伴隨大量脫屑[1]。大量國(guó)內(nèi)外報(bào)道稱PPP的發(fā)病機(jī)制與扁桃體炎、牙周炎或金屬過敏的發(fā)病有關(guān)聯(lián)[2]，但具體的治病機(jī)理仍未發(fā)現(xiàn)明確的定論。Barber首次提出PPP可以作為銀屑病的一個(gè)分型并且Brunasso等[3]從流行病學(xué)和臨床表現(xiàn)等方面比較發(fā)現(xiàn)，兩者存在多個(gè)相同點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)20例PPP患者的臨床資料綜合分析后，采用三種不同檢測(cè)方法對(duì)掌跖膿皰病患者外周血白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-36s（IL36s）包括IL-36α、IL-36β和IL-36γ 3種細(xì)胞因子的表達(dá)水平，以及皮損處表皮組織細(xì)胞IL-36s變化程度，探討IL-36s在掌跖膿皰病的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 材料

皮損組織均來自2015-01~2015-12醫(yī)院皮膚科門診病房，采集了20例掌跖膿皰病患者，所有病例的確診均符合掌跖膿皰病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。同期收集對(duì)照組正常者20例，所有受試者在受試前均需簽署知情同意書，上述實(shí)驗(yàn)均通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的許可。

1.2 方法

1.2.1臨床資料和血清及標(biāo)本收集 所有入組受試者均進(jìn)行了一系列的相關(guān)確診實(shí)驗(yàn)，并詳細(xì)記錄。受試者晨起空腹的外周靜脈血5～7mL，室溫下靜置15～20min，離心4℃、3500r/min、8min，血清分裝保存，于-70℃冰箱備用。掌跖膿皰病患者實(shí)驗(yàn)組與健康對(duì)照組組織活檢標(biāo)本取自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，經(jīng)HE染色病理確診為掌跖膿皰病，標(biāo)本取出后迅速置于液氮速凍待用。

1.2.2細(xì)胞因子測(cè)定采用固相夾心ELISA方法檢測(cè)受試病人血液中的IL-36α，IL-36β，IL-36γ的濃度以人IL-36s的ELISA試劑盒購買自武漢云克隆科技股份有限公司（SCL621Hu）說明書參照進(jìn)行試驗(yàn)。提前取出ELISA試劑盒，于室溫下放置20min，然后制備洗滌劑。首先，將100μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品添加到反應(yīng)板中以獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在室溫下孵育2h，然后洗滌并補(bǔ)充100μL在室溫下孵育的檢測(cè)抗體。2h后，洗滌并補(bǔ)充100μL的鏈霉親和素-HRP工作稀釋液，在室溫下孵育20min。將板洗滌3次，補(bǔ)充100μL底物，在避光的情況下在室溫下溫育20min，并立即補(bǔ)充終止溶液以終止反應(yīng)。最終通過多模式酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek Instruments）在450nm處測(cè)量。

1.2.3免疫組化實(shí)驗(yàn) 免疫組化實(shí)驗(yàn)法，具體步驟如下：（1）4μm的石蠟片采用連續(xù)的切片，均勻的平鋪于APES玻片，置于80℃的烘片機(jī)上，烘30min；（2）石蠟片浸入Ⅰ和Ⅱ均為二甲苯的液體，脫蠟分別為10min左右完成；（3）侵入連續(xù)梯度濃度的乙醇：I號(hào)：100%-II號(hào)：100%-III號(hào)：95%-IV號(hào)：80%-V號(hào)：70%，每個(gè)濃度梯度浸泡5min，然后去離子水沖洗2次，每次2min，PBS（pH7.4）沖洗2次，每次2min，進(jìn)行脫蠟水化；（4）切片侵入檸檬酸緩沖液，進(jìn)行微波修復(fù)，大火4min轉(zhuǎn)中火10min，冷卻至室溫后，選用pH7.4的PBS洗3遍，總共9min，沖洗時(shí)勿破壞皮損組織；（5）將配置好的3%的雙氧水（去離子水稀釋30%雙氧水），置37℃、10～15min。PBS需要沖洗5min；（6）每張切片滴加一滴山羊血清，37℃下孵育15min，PBS（pH7.4）沖洗3次，每次3min；（7）去掉血清，吸干，加入一抗，37℃至30min。PBS洗9min；（8）吸干切片，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃至30min。PBS洗12min；（9）切片滴加顯色液DAB（新配置）；（10）Harris復(fù)染，約1min后水洗，1%濃度鹽酸乙醇分化，洗至藍(lán)色；（11）自來水沖洗，切片放入乙醇：70%-80%-95%-100% I-100%II-二甲苯I-II脫水，每個(gè)浸入低于2min；（12）收集皮損組織旁加入中性樹脂，蓋玻片蓋好晾干；（13）顯微鏡觀察切片，采集圖像后取陽性對(duì)照為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；正常皮膚組織為正常對(duì)照。

1.2.4IL-36s免疫組化法判定的結(jié)果IL-36s于表皮各層細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：（1）低倍鏡選擇石蠟切片陽性細(xì)胞密集、清晰的15個(gè)視野，觀察計(jì)算陽性細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞高倍鏡下的比例。計(jì)算上述比例的平均值，即可得出IL-36s所在細(xì)胞的陽性數(shù)量的比例；（2）陽性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度評(píng)分：①著色細(xì)胞占比百分率分為5種5個(gè)分值：＜5%：0分，5～25%：1分，26～50%：2分，51～75%：3分，>75%：4分；②按照呈色細(xì)胞顏色：0分：無色、1分：淡黃色、2分：棕黃色、3分：棕褐色；③上述兩步相乘分出陽性等級(jí)；0分：陰性（—），1～4分：（+），5～8分：（++），9～12分：（+++）。

1.2.5RNA的逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) 采用RNAiso Plus（Taraka）方法提取人皮膚組織樣本中總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR，（GoTaq qPCR Master Mix Promega、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo）合成cDNA。檢測(cè)目的基因，在各樣本中的表達(dá)。PCR條件如下：預(yù)變形95℃3min，變形95℃10s，退火60℃20s，延伸72℃20s，循環(huán)45次，每個(gè)重復(fù)3次。內(nèi)參GAPDH，2（-ΔCt）計(jì)算方法，得出目的基因具體的表達(dá)量，PCR引物（見表1）。

表1 IL36s基因的引物序列

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

GraphPad Prism8進(jìn)行F test to compare variances及Ordinary one-way ANOVA分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。t檢驗(yàn)用于獨(dú)立樣本組間比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化陽性細(xì)胞百分比利用卡方檢驗(yàn)比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-36s在掌跖膿皰病血清中的表達(dá)

ELISA結(jié)果表明，對(duì)納入本研究的20例掌跖膿皰病和20例正常者的臨床資料進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)，患者血清中IL-36α濃度顯著的上升[normal：（26.97±25.60）pg/mL VS patient：（595.2±1041.65）pg/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見圖1），細(xì)胞因子IL-36β和IL-36γ，在健康者和PPP患者血清中濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[IL-36β normal：（8.02±477.88）pg/mL VS patient：（149.86±512.34）pg/mL]（P>0.05）（見圖2），IL-36γ[normal：（34.02±60.23）pg/mL VS patient：（27.48±83.97）pg/mL]（P>0.05）（見圖3）。

圖1 健康人與PPP患者血清中IL-36α含量比較(pg/mL,mean±SD)

圖2 健康人與PPP患者血清中IL-36β含量比較(pg/mL，mean±SD)

圖3 健康人與PPP患者血清中IL-36γ含量比較(pg/mL，mean±SD)

2.2 PPP患者與健康組表皮組織中IL-36s mRNA的比較

PPP患者表皮組織中IL-36α的表達(dá)水平明顯高于正常組，差異存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（0.0016±0.004）VS 0]（P＜0.01）（見圖4）。IL-36β以及IL-36γ其表達(dá)水平在PPP患者和健康組之間無顯著差異（P>0.05）（見圖5、6）。

圖4 健康人與PPP患者組織中IL-36AmRNA比較

圖5 健康人與PPP患者組織中IL-36B mRNA比較

圖6 健康人與PPP患者組織中IL-36G mRNA比較

2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)

2.3.1IL-36s體內(nèi)表達(dá)部位 檢測(cè)IL-36α的在表皮各層組織中的表達(dá)，通過對(duì)樣本的免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)PPP患者相對(duì)于健康對(duì)照組，IL-36α在表皮全層組織中陽性細(xì)胞明顯增多，而兩組中IL-36β和IL-36γ兩個(gè)炎癥因子的表達(dá)在表皮各層中的陽性細(xì)胞分布基本相同，且未見明顯增多（見圖8）。

2.3.2表皮中IL-36α表達(dá)數(shù)量 患者組和正常組表皮各層細(xì)胞中IL-36α表達(dá)，陽性率分別為85%（17/20）和10%（2/20），有顯著性差異（P<0.05）。而IL-36β和IL-36γ的表達(dá)陽性率在兩組間無顯著差異（P>0.05）（見圖7、圖8A、B、C）。

圖7 健康人與PPP患者表皮細(xì)胞中IL-36α染色結(jié)果比較（X40）

2.3.3IL-36s在表皮中陽性比率及表達(dá)強(qiáng)度的比較

患者組表皮各層細(xì)胞中IL-36α的表達(dá)強(qiáng)度（65.2%）高于健康對(duì)照組（5.5%）存在顯著差異（P<0.05）（見圖8A）。而IL-36β、IL-36γ在PPP患者組及對(duì)照組的表達(dá)未見明顯差異（P>0.05）（見圖8B、C）。IL-36α，IL-36β，IL-36γ在同一PPP患者表皮組織中陽性表達(dá)的強(qiáng)度存在差異，IL-36α的表達(dá)明顯高于后兩者（見圖8D）。

圖8 健康人與PPP患者表皮細(xì)胞中IL-36α、IL-36β、IL-36γ含量比較（A，B，C分別表示IL-36α,IL-36β,IL-36γ在PPP患者及健康對(duì)照組表皮中陽性細(xì)胞比率的差異，D表示IL-36α，IL-36β,IL-36γ在PPP患者表皮組織中陽性表達(dá)的強(qiáng)度差異）

3 討論

掌跖膿皰病PPP是較為多發(fā)于掌跖部位，其屬于慢性復(fù)發(fā)性皮膚病，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于誘發(fā)PPP病的病因尚未清楚。PPP發(fā)病與其體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)包括免疫系統(tǒng)、精神狀態(tài)以及全身的內(nèi)分泌系統(tǒng)，多功能失調(diào)存有著密切關(guān)聯(lián)。Camp對(duì)“膿皰型銀屑病”給出分類，掌跖膿皰病劃分為局限性膿皰型銀屑病。主要發(fā)病年齡在30～60歲，女性居多。其發(fā)病的主要表征為紅斑基礎(chǔ)上，反復(fù)出現(xiàn)無菌性膿皰，并伴有一定量的角化、脫屑以及中度或嚴(yán)重瘙癢[6]。

IL-36s：IL-36α、IL-36β和IL-36γ[5]，3個(gè)功能相似的生物學(xué)分子均屬于IL-1中的一種，人體血液中的IL-36s需要通過與IL-36R這種特異性受體相結(jié)合，才能發(fā)揮促炎作用，IL-36Ra是主要的受體拮抗劑。IL-36s、IL-36R和IL-36Ra三個(gè)相關(guān)炎癥因子在皮膚、氣管和食道等上皮組織細(xì)胞含量高的部位大量表達(dá)[7]。而角質(zhì)的形成是基于免疫細(xì)胞中的單核細(xì)胞和B細(xì)胞等受到應(yīng)激后，活化產(chǎn)生的IL-36s。IL-36s、IL-36R與IL-36Ra三個(gè)蛋白組成IL-1家族的一條新的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在其作用下啟動(dòng)IL-36s相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮促炎作用，IL-36R和IL-36Ra相結(jié)合的復(fù)合物不能再結(jié)合IL-1 RAcP，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活收到抑制，從而起到抗炎作用[8～12]。IL-36s、IL-36R與PPP的發(fā)病緊密相關(guān)，病理組織的特點(diǎn)：棘層肥厚和真皮內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其特點(diǎn)與銀屑病皮損較為一致，且皮損組織處IL-17、IL-22、IL-23和抗菌肽等的基因表達(dá)呈明顯增多。銀屑病與掌跖膿皰病在種屬上可以歸為一類，通過相關(guān)報(bào)道可知，IL-36β和IL-36γ表達(dá)水平在銀屑病發(fā)作期顯著升高，且隨著病情的發(fā)展，IL-36β和IL-36γ表達(dá)水平在重度的銀屑病患者體內(nèi)顯著升高，其表達(dá)水平的升高是銀屑病發(fā)病機(jī)制的重要組成部分[13]，而IL-36α和IL-36Ra血清表達(dá)水平?jīng)]有變化，根據(jù)上述的推斷我們?cè)O(shè)計(jì)并進(jìn)行了本次實(shí)驗(yàn)，對(duì)PPP的疾病過程中IL-36s相關(guān)因子的變化做出了驗(yàn)證。

我們采用三種方法驗(yàn)證：（1）ELISA主要檢測(cè)PPP的發(fā)病組及正常對(duì)照組血清中IL-36α、β和γ三個(gè)指標(biāo)的濃度，結(jié)果顯示：患組和對(duì)照組的IL-36β和IL-36γ表達(dá)無差異，IL-36α因子表達(dá)水平在PPP膿皰發(fā)作期顯著升高，與銀屑病的炎癥因子IL-36表達(dá)有所不同；（2）熒光定量PCR法驗(yàn)證IL-36α表達(dá)水平在PPP患者與健康對(duì)照組血清中呈高度正相關(guān)；（3）免疫組化方法，在皮損組織處炎癥細(xì)胞明顯增多，其中表皮炎癥細(xì)胞IL-36α表達(dá)顯著增高，以上研究結(jié)果提示，IL-36α、IL-36β和IL-36γ在患者血清中可能有相似的生物學(xué)活性，但是對(duì)于不同的膿皰性疾病，表達(dá)情況會(huì)有明顯差異。之前推測(cè)的IL-36R在PPP患者中可能參與發(fā)病，鑒于ELISA法和熒光定量PCR法均沒有看出差異，關(guān)于IL-36R在PPP發(fā)病中的影響需要進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)的基因檢測(cè)和一些體外試驗(yàn)。

綜上所述，根據(jù)本研究結(jié)果提示IL-36α在PPP血清及組織中均存在高表達(dá)，在PPP的發(fā)病過程中可能起到重要作用。但I(xiàn)L-36α在PPP患者血清和皮膚組織中高表達(dá)對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展有何具體影響，包括IL-36相關(guān)的其它細(xì)胞因子在掌跖膿胞病中的作用，尚需擴(kuò)大樣本量，同時(shí)需要豐富檢測(cè)方法從而進(jìn)行更全面更進(jìn)一步的證實(shí)。