閩楠葉斑病病原菌的分離鑒定及其生物學特性

姚 英， 于 存

(貴州大學 林學院， 貴州 貴陽 550025)

閩楠(Phoebebournei)俗稱楠木，屬樟科(Lauraceae)楠屬(Phoebe)常綠大喬木，是我國特有物種，為國家二級保護植物，分布于福建、江西、湖南、廣西、廣東、貴州、浙江和湖北等地[1]。其材質通直并帶有特殊香味，紋理精美，廣泛用于建筑、家具、雕刻行業和精密木模的制作。同時，楠木冠大蔭濃，樹姿優美，是優良的園林綠化樹種[2]。此外，閩楠還有凈化空氣、隔音降噪和殺菌驅蟲等生態功能，廣泛用于香料提取及化妝品研發領域[3]。由于野生資源過渡采伐，導致楠木瀕臨滅絕，現已開始大量人工栽植[4-5]，但其種植過程中常伴有多種病蟲害的發生，尤其是葉斑病已成為閩楠葉部的主要病害之一，且遍布各閩楠育苗基地及幼齡林分布區。閩楠葉斑病染病初期受害部位出現紅褐色圓形斑點，向外擴展，由許多小病斑塊融合成不規則的大斑，最后導致葉片退綠，嚴重致其死亡。炭疽菌屬(Colletotrichumspp.)是主要的植物致病菌和病原菌，分布廣、寄主多，可危害谷物、水果蔬菜和核桃等多種農林植物，對農林業生產威脅極大[6]。膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)是炭疽菌屬的重要種類，可引起橡膠、芒果和香蕉等多種植物炭疽病[7]，C.gloeosporioides具有集合種和復合種的特點，種內菌株間變異大，有數個專化型或生理小種[8]。目前，在閩楠上已發現小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)可引起葉斑病[9]。筆者在調查閩楠病害時發現，除P.microspora可引起閩楠葉斑外，還有其他病原菌可引起閩楠葉斑病。因此，探明引起某一植物病害的膠孢炭疽菌生物學特性，明確其引發病規律和發病特點，對該原菌引起的植物病害的防治具有重要意義。從貴州省都勻市螺絲殼自然保護區采集閩楠典型葉斑病病葉，對其進行病原菌的分離與鑒定，探明其生物學特性，以期為閩楠葉斑病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

閩楠典型葉斑病病葉樣品共計30片，采自貴州省都勻市螺絲殼自然保護區。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 采用常規組織分離法分離閩楠葉斑病病原菌，首先用1%次氯酸鈉進行葉片表面消毒3～5 min，后用無菌水清洗3～5次，無菌條件下，剪取病健交界處約3 mm×3 mm的組織放置在PDA平皿，每個平皿放置3塊病組織，每個葉片3次重復，30個葉片共90個處理。之后將樣品于(25±2) ℃條件下培養，當樣品邊緣生長出菌絲時及時挑取邊緣菌絲尖端轉移至新的PDA平皿中進行菌株純化，直至獲得純化菌株。獲取真菌菌株后根據菌落、菌絲和孢子特征進行合并，確定主要種類后統計不同真菌的分離率。

分離率=某一真菌分離個數/所有真菌分離個數×100%

1.2.2 病原菌的致病性測定 隨機選取分離得到的相同種真菌菌株5株按照柯赫氏法進行離體葉片的回接。將20年生閩楠健康葉經75%酒精表面消毒后，用無菌昆蟲針輕輕刺傷表面，用打孔器截取直徑為0.5 cm真菌菌餅置于刺傷部位，用濕脫脂棉保濕，25℃恒溫培養10 d，觀察不同真菌是否引起閩楠葉片葉斑的癥狀。選擇回接后產生明顯葉斑病的葉片，由發病的病健交界處，利用組織分離法再次分離病原菌，利用形態學方法比較再分離菌株與原接種菌株形態特征是否一致，以上每個真菌離體回接20片葉。

1.2.3 病原菌的鑒定

1) 形態學鑒定。將回接引起閩楠葉斑的病原菌接種至PDA平板上，于25℃暗培養5 d，培養過程中觀察菌落顏色、形狀、氣生菌絲的疏密程度等形態特征，并采用插片法獲取病原菌菌絲和孢子，觀察記錄菌絲和孢子的分支及大小，參照陸家云的方法進行病原菌的形態學鑒定[10]。

2) 分子學鑒定。在PDA平板上活化閩楠葉斑病病原菌，利用接種鉤刮下平板上生長的菌絲體用于病原菌基因組的提取。病原菌基因組提取采用CTAB法，用真菌ITS通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCT-CCGCTTATTGATATGC-3′)擴增病原菌的目的基因序列。PCR反應體系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L d NTP 2 μL、Taq 酶0.2 μL、模板 DNA 1 μL、25 μmol/L引物ITS1和ITS4各0.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR 擴增條件：95℃預變性4 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物的純化和序列測定委托重慶擎科生物技術有限公司進行，所得到的核苷酸序列進行在線NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比對分析，應用MEGA 7.0中的臨近法(Neighbor-joining，NJ)構建病原菌ITS的系統進化樹，系統進化樹構建過程中采用Bootstrap法進行檢驗，重復計算1 000次后確定菌株的分類地位。

1.2.4 不同因素對病原菌菌絲體生長的影響

1) 培養基。供試培養基有水瓊脂(WA)培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養基、PDA+維生素B6(PDA+VB 6)培養基、PDA+楠木煎汁(Ph.bournei’s leaf agar，PBLA)培養基、孟加拉紅(Rose Bengal Agar)培養基、查彼培養基(Czapek Dox Agar) 、SNA培養基(Synthetic low nutrient Agar) 、燕麥瓊脂培養基(Oatmeal agar medium，OA)。將直徑為5 mm的菌餅接種至不同培養基，25℃暗培養5 d，然后采用“十字交叉法”測定菌落生長直徑，5次重復。

2) 溫度。試驗溫度設15℃、20℃、25℃、30℃和35℃共5個梯度，取直徑為5 mm的菌餅接至PDA平板中央，分別在不同溫度條件下暗培養5 d，然后采用“十字交叉法”測定菌落生長直徑，5次重復。

3) pH。用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液分別調節PDA培養基pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共5個梯度，取直徑5 mm 菌餅分別接種于不同pH的PDA培養基平板，25℃條件下暗培養5 d，然后采用“十字交叉法”測定菌落生長直徑，5次重復。

4) 光照。取直徑5 mm菌餅接種至PDA平板中央后，分別置于全黑暗、12 h光暗交替和日光燈連續照射條件下，25℃暗培養5 d，然后采用“十字交叉法”測定菌落生長直徑，5次重復。

5) 碳、氮源。以查彼培養基為基礎培養基，將等量的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、果糖為碳源，以不添加碳源為對照；將等量的蛋白胨、尿素、硝酸銨、酵母浸粉、牛肉膏為氮源，以不添加氮源作為空白對照；取直徑5 mm 菌餅分別接種于不同條件的培養基，25℃條件下暗培養5 d，然后采用“十字交叉法”測定菌落生長直徑，5次重復。

6) 菌絲的致死溫度。設40℃、45℃、50℃、55℃和60℃共5個梯度，在無菌環境下，將無菌水加入5 mL的離心管中，取直徑5 mm菌餅放入離心管中并置于不同溫度的水浴鍋中水浴10 min，再接回PDA平板中，25℃條件下暗培養5 d，然后采用“十字交叉法”測定菌落生長直徑。5次重復。

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0對數據進行統計分析，用最小顯著差數(LSD)法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 病原菌及其致病性

從閩楠患病葉片品中共分離得215個真菌菌株，經形態學初步檢測合并菌株后確定為15種。分離后確定的菌株按回接試驗結果顯示，菌株CB-2和CB-3均可產生葉斑病癥狀(圖1B)。其中，菌株CB-2和CB-3在30片病葉樣品中均有出現，其分離率分別為78.0%和86.0%。觀察閩楠葉斑病癥狀發現，病害初期在侵染點周邊呈黑點狀，后期逐漸擴大形成黑褐色不規則病斑，病斑邊上常產生密集的黑色小點，潮濕環境下發病部位常密布病原菌絲，與野外自然發病癥狀一致(圖1A)。對離體回接葉片進行病原菌的再分離，經形態學對比，同樣與菌株CB-2和CB-3一致。經柯赫氏法驗證，可確定菌株CB-2和CB-3為閩楠葉斑病致病菌。

注：A為野外發病病樣，B為離體回接致病癥狀。

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 形態學 菌株CB-2在PDA平板上的菌落生長呈圓形(圖2-A)，初期為白色，培養5～6 d后變為鼠灰色，菌絲蓬松，有黑色小點，背面為黃綠色，近圓形，氣生菌絲濃密(圖2-B)。菌落生長速率12.4 mm/d。其分生孢子為無色，單胞，呈圓柱形，兩端鈍圓，大小為(15.0～25.0)μm×(4.0～7.5)μm(圖2C～D)。根據《植物病原真菌學》的方法初步鑒定菌株CB-2為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloesporioides)。菌株CB-3在PDA平板上菌落為白色絮狀，氣生菌絲濃密，背部淡黃色，具輪紋，生長較快。20 d 后菌絲表面形成黑色墨汁狀黏液，排列松散不規則，即為分生孢子堆，分生孢子梗短，圓柱形，無色。成熟分生孢子紡錘形，直或略彎，具4隔膜5細胞，大小(18.4～22.5)μm×(5.0～7.5)μm，初步鑒定菌株CB-3為小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)[9]。

注：A為菌株CB-2的菌落，B～D為菌株CB-2的孢子及菌絲。

2.2.2 rDNA-ITS序列分析 以菌株CB-2總DNA為模板，ITS1/ITS4為引物擴增得到長度542 bp的序列，GenBank接收號為MK728960。該菌株序列經NCBI在線BLAST比，與GenBank號為MH700457.1、MF379341.1的膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)的堿基序列覆蓋度達100%，序列相似度高達99%。用MEGA7.0 NJ法構建系統發育樹后發現其形成明顯的分枝，其中菌株CB-2與不同菌株來源的膠孢炭疽菌聚類為同一分枝(圖3)，遺傳距離最近，結合形態學特征確定菌株CB-2為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)。

注：●為菌株CB-2，◆為外源菌株。

2.3 不同因素對膠孢炭疽菌菌絲體生長的影響

2.3.1 培養基 從圖4可知，PSA培養基最利于膠孢炭疽菌菌落的生長，培養5 d后的菌落直徑達9 cm，且菌絲最為茂密。在燕麥培養基上菌落生長速度僅次于PSA培養基，但在燕麥培養基上菌絲生長太過稀薄。在PDA+楠木葉煎汁瓊脂培養基上菌落直徑位于燕麥培養基之后。在察氏、SNA、PDA+維生素B6培養基中菌落生長較慢，在PDA、虎紅培養基上菌落直徑顯著降低，在對照組WA培養基上基本不生長。PSA培養基菌落直徑顯著大于其余培養基，WA培養基菌落直徑顯著小于其余培養基，其余基培養基間菌落直徑差異顯著或不顯著。

圖4 不同培養基閩楠葉斑病病原菌菌絲的生長狀況

2.3.2 溫度、pH與光照 從圖5看出，不同溫度、pH和光照下閩楠葉斑病病原菌菌落的生長狀況。溫度：病菌菌落在15～35℃均可生長，以25℃時菌絲的生長速度最快，各溫度下菌絲的生長速度依次為25℃>30℃>20℃>15℃>35℃。其中，25℃時菌絲的生長速度顯著大于除30℃外的其余溫度處理，35℃菌絲的生長速度顯著小于其余溫度處理。pH：為9.0時菌落直徑最大，各pH下菌落的生長速度依次為pH 9.0>pH 7.0>pH 8.0>pH 5.0>pH 6.0，pH 9.0與pH 7.0菌落直徑顯著大于其余pH處理，但二者間差異不顯著，其余pH處理間差異不顯著，表明該菌株不適宜在過酸或過堿的環境下生長。光照：全光照條件下菌落生長最好，菌落直徑為9 cm；光暗交替次之，菌落直徑為4.6 cm；全黑暗條件最差，菌落直徑為3.9 cm；全光照顯著大于光暗交替和全黑暗，光暗交替和全黑暗間差異不顯著。此外，在全黑暗情況下，菌絲生長擴散性不強，生長比較密集，趨于塊狀生長。

圖5 不同溫度、pH和光照下閩楠葉斑病病原菌菌絲的生長狀況

2.3.3 碳源與氮源 從圖6可知，不同碳源和氮源下閩楠葉斑病病原菌菌落生長的變化。碳源：各處理菌株均可生長，但菌落直徑存在差異。菌落直徑以麥芽糖最大，為4.90 cm；對照最小，為1.6 cm；各處理依次為麥芽糖>葡萄糖>蔗糖>果糖>可溶性淀粉>乳糖>對照。其中，麥芽糖顯著大于除葡萄糖和蔗糖外的其余處理，對照顯著小于其余處理，其余處理間差異顯著或不顯著。氮源：各處理菌株均可生長，但菌落直徑存在差異。菌落直徑以酵母浸粉最大，為4.3 cm；尿素最小，為0.5 cm；各處理依次為酵母浸粉>硝酸銨>蛋白胨>牛肉膏>對照>尿素。酵母浸粉顯著大于其余處理，尿素顯著小于除對照外的其余處理，其余處理間差異顯著或不顯著。

圖6 不同碳源與氮源下閩楠葉斑病病原菌菌絲的生長狀況

2.3.4 膠孢炭疽菌菌絲致死溫度 不同溫度水浴處理結果表明，菌絲塊在35～45℃水浴處理10 min后，置于PDA平板上培養，均可正常長出菌絲，50℃、55℃和60℃處理10 min，培養10 d后仍未觀察到菌絲生長?？梢?，膠孢炭疽菌菌絲的致死溫度為50℃下10 min。

3 結論與討論

閩楠是我國特有樹種，該樹種的生理特性、苗木繁育、群落生態、遺傳多樣性和野外資源等已有研究報道[11-14]，但對閩楠病害的研究報道極少。陳全助等[9]研究結果表明，引起閩楠葉斑病的病原菌為小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)。研究結果表明，除P.microspora可引起閩楠葉斑病外，膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)也可引起閩楠葉斑病的發生。C.gloeosporioides寄主范圍廣泛，可侵染山楂、蘋果、桂花、決明子和柿樹等多種樹種，引起相關病害[15-19]，C.gloeosporioides侵染閩楠葉片引起葉斑病為國內首次報道。

研究結果表明，C.gloeosporioidesCB-2的生物學特性與張翊等對C.gloeosporioides的生物學特性研究結果不完全一致[20]，這可能與菌株來源不同或菌株所處環境差異有關。C.gloeosporioidesCB-2在25℃時更利于菌株的生長，當溫度繼續升高或下降菌株生長均呈下降趨勢。推測閩楠葉斑病的發生多在25℃左右，因此，在這個溫度對應的季節之前應做好該病害的防控工作。全光照更利于菌株的生長，結合閩楠自身生長特性為陰性樹種，因此，要盡量避免閩楠幼苗栽植在光照較強的地域，或在幼苗栽植過程中做好遮陰處理，即可滿足閩楠自身生長特性所需，也可減少閩楠葉斑病的發生。另外，結合C.gloeosporioidesCB-2的其他生物學特性及閩楠生長特性，在其幼苗栽植及管護過程中要注意合理的播種密度，保持苗木通風，適度噴灌，控制幼苗期光照時長，做好遮陰處理，在溫度達25℃前做好病害的防控工作。