基于基因測序的地下咸水微生物多樣性研究

桑石磊， 黃柏強

(生態環境部 華南環境科學研究所， 廣東 廣州 510535)

許多沿海城市都受到地下水咸化作用的影響，其誘發因素多種多樣，包括生活和工業廢水[1]、古海水[2]及現代海水入侵[3]等。為了探明地下水鹽分的來源以及地下水鹽漬化對人類生活和生態系統的影響，已經有一些學者對海水入侵區域的水文地球化學過程和微生物群落的變化進行研究[2-4]。有研究表明，海水入侵作用引起地下水的污染和微生物群落發生變化[5-6]。然而，由于地下生態系統猶如“黑盒子”的復雜性，地下水微生物的多樣性和群落尚未得到充分研究。微生物是地下水生態環境的唯一棲息者，將近1/2的原核生物都藏在地下，驅動著很多重要生源要素的生物地球化學循環，與營養物質的運輸、物質轉換和污染物的降解密切相關。許多含水層的環境條件(溫度、pH、水化學和流速)幾乎是穩定的，微生物群落不受地表的直接影響。因此，研究地下微生物群落結構對有效認識地下水和更好地利用和保護地下水具有非常重要的理論意義和實踐價值。近年來，隨著分子微生物學及其相關技術的快速發展，目標DNA的鑒定和定量分析解決了利用微生物學進行地下環境微生物研究存在的難題[7]。HEEJUNG等[8]綜合水文地質學、分子微生物學和同位素分析方法，研究微生物群落結構與地球化學過程的相互作用認為，多學科綜合研究是追蹤污染源和微生物過程的有效工具。筆者近年來參與海水入侵相關的研究項目，對珠江三角洲地區和北萊州灣地區地下水的水文化學、微生物群落多樣性特征進行長期的研究，取得一些與地下水環境監測、環境影響因素等相關的研究成果。為進一步研究地下咸水微生物群落的多樣性特征提供參考，基于高通量測序技術，研究珠江三角洲地區和萊州灣地區地下咸水區微生物的多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

選取萊州灣地區50余口民用井(圖1)，待水體流出一段時間后用干凈的塑料桶取水體10 L；在廣州南部地區選取12口地下水監測井，采集水體5 L，用0.22 μm濾膜過濾收集水體樣品。

圖1 民用井采樣點的位置分布

1.2 方法

1.2.1 海水入侵對民用飲水井咸水區微生物群落的影響 以電導率>1 500 μS/cm作為海水入侵的標準，調查50余口民用井水體的理化性質，溫度、pH、水位、電導率等指標使用電導率儀現場測試，其余理化因子在室內分析測試。選取其中5口典型的監測井，過濾水樣得到微生物樣品，經過DNA的提取和高通量測序，分析微生物的種類和多樣性。

1.2.2 珠三角咸水區的微生物群落組成 研究珠江三角洲地下咸水區微生物群落的多樣性特征，以廣州南部地區采集的12個地下水監測井水樣為研究對象，采用高通量測序技術，經過DNA的提取和高通量測序，分析微生物的種類和多樣性。

1.2.3 不同咸水區微生物的異同 根據DNA測序結果，比較研究南方和北方不同的海水入侵地區微生物群落的相似性和差異性。

2 結果與分析

2.1 海水入侵對民用飲水井咸水區微生物群落的影響

調查50余口民用井水體的理化性質發現，高達70%的民用井受到海水入侵的影響，最高的電導率值為8 390 μS/cm，平均值為2 300 μS/cm。經過對5口典型監測井水樣過濾得到的微生物樣品的DNA提取和高通量測序發現，海水入侵作用對飲用水體中主要的離子濃度有一定的影響，且影響微生物的多樣性和群落結構。不同鹽度水體中高豐度的微生物類型不同，在淡水中主要是β-變形菌，在微咸水中主要是擬桿菌屬和紅細菌屬，而在咸水中是Perlucidibaca。此外，在咸水水體中的一些菌群，如假單胞菌屬和黃桿菌屬，容易在水體中形成菌膜，有助于致病菌的生存和繁殖[9]。

2.2 珠三角咸水區微生物的群落組成

從圖2看出，珠江三角洲地下咸水區微生物群落的多樣性特征。門的水平：地下水中的微生物類群主要包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、廣古菌門(Euryarchaeota)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和Woesearchaeota。綱的水平：豐度較高的是γ-變形菌綱和厚壁菌門的芽孢桿菌綱。屬的水平：有微小桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬、食酸菌屬、甲烷球菌、脫硫弧菌屬和叢毛單胞菌屬等。其中，厚壁菌門能夠產生孢子抵抗不利的環境條件，采樣區有大量厚壁菌門的微生物存在，表明，廣州咸水入侵區地下水環境對微生物的生存而言不是一個適宜的生態環境，可能與廣州地下水中存在大面積的高鹽度環境及其他的環境污染源有關。還有擬桿菌門的微生物存在，其可以降解有機物質，對地下水環境的自然凈化過程非常重要。然而微生物降解污染物的過程比較緩慢，而且不能超過一定的限度，還需要比較適宜的環境，擬桿菌門只在一些地區出現，可能是地下咸水環境限制了此類群微生物的大量繁殖與擴散。

圖2 微生物群落結構門水平上的分類

有研究顯示[10]，該地區地下環境中存在大量的海侵時期的古生物沉積層，在源源不斷釋放鹽分的同時，也釋放了大量的有機物，從而使得高咸水區微生物的多樣性較高。此外，由于降雨和地表水的補給，對地下咸水有稀釋作用，在一些補給頻繁的地區，造成地下環境的鹽度波動較大，對微生物的生長不利，從而可能導致該地區微生物多樣性較低。比較不同鹽度梯度下微生物群落的組成特征發現，中度咸水和微咸水的OTUs比高鹽度的地下水樣品更相似；而不同鹽度的樣品有很多共享的OTUs，說明，淡水和鹽水之間有強烈的交換。影響地下水微生物群落的主要環境因子包括鹽度、pH和總氮。

2.3 不同咸水區微生物的異同

對比珠江三角洲和萊州灣地區不同海水入侵地區微生物群落的相似性和差異性(圖3)發現，地下水主要的細菌類群有很大的相似性，主要的類群均為變形菌門的γ-，β-和α-變形菌綱以及厚壁菌門的芽孢桿菌綱。但不同地區其他細菌類群組成存在一定差異，如在萊州灣地下水體中放線菌綱、擬桿菌綱和鞘脂桿菌綱的豐度比較高，而在珠江三角洲地下水中ε-、δ-變形菌綱豐度比較高。不同地區之間的差異是由多種因素共同作用引起的，如地質構造、周圍環境及地下水流動性等，其對微生物群落也會產生影響。此外，在咸水區檢測到的一些微生物類群，如交替單胞菌目(Alteromonadales) 、海桿菌屬 (Marinobacter)和海洋螺菌目(Oceanospirillales)等，可以作為潛在的海水入侵的標志性物種，為咸水區的微生物監測指示提供了研究方向。

圖3 珠江三角洲(a)和萊州灣地區(b)不同海水入侵地區地下水微生物群落綱水平上的比較

3 小結

研究基于高通量測序技術對比了珠江三角洲(南方)和萊州灣地區(北方)不同海水入侵地區微生物群落的相似性和差異性，結果表明：萊州灣地區50余口民用井中70%的民用井受到海水入侵的影響，最高電導率為8 390 μS/cm，平均為2 300 μS/cm；不同鹽度水體中高豐度的微生物類型存在差異，淡水中主要是β-變形菌，微咸水中主要是擬桿菌屬和紅細菌屬，而咸水中主要是Perlucidibaca。珠江三角洲地下咸水區微生物群落豐度較高的門、綱和屬分別是變形菌門、厚壁菌門及奇古菌門等7個門，γ-變形菌綱和芽孢桿菌綱2個綱，微小桿菌屬、假單胞菌屬及不動桿菌屬等8個屬。2個地區地下水微生物群落結構有很大的相似性，主要類群均為變形菌門的γ-，β-和α-變形菌綱以及厚壁菌門的芽孢桿菌綱；也存在一定的差異，萊州灣地下水體中以放線菌綱、擬桿菌綱和鞘脂桿菌綱的豐度比較高，珠江三角洲地下水體中以ε-、δ-變形菌綱豐度較高。一些微生物如交替單胞菌目等，可以作為潛在的海水入侵標志性物種，表明微生物群落在不同海水入侵地區的環境指示意義。