按法刺激肌筋膜激痛點模型大鼠局部對TRPV1的影響

袁媛 蔣全睿 吳瓊 朱曉晴 匡小霞 江玉婷 李鐵浪 李武 李江山

〔摘要〕 目的 研究按法刺激激痛點是否通過激活辣椒素受體1（transient receptor potential vanillic acid subtype 1， TRPV1）進而產生效應，初步探討按法止痛的作用機制。方法 60只SD大鼠隨機分為空白組10只和造模組50只，空白組不進行造模和干預操作，僅正常飼養;造模組以局部擊打配合離心跑臺法建立大鼠慢性激痛點模型。造模成功后，將40只成模大鼠再隨機分為模型組、按法組、按法+抑制劑組、按法+溶劑組，每組10只。模型組不進行干預;按法組給予局部按法治療;按法+抑制劑組給予腹腔注射辣椒平溶液（TRPV1抑制劑）和局部按法治療;按法+溶劑組給予腹腔注射溶劑和局部按法治療。按法操作由自制按法儀器進行。取材后以免疫組化法檢測TRPV1;以酶聯免疫吸附法測定內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide sgnthase， eNOS）、一氧化氮（nitric oxide， NO）和五羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）含量。結果 （1）與空白組相比，模型組TRPV1平均光密度值增高（P<0.05）;與模型組相比，按法組和按法+溶劑組TRPV1平均光密度值增高（P<0.05），按法+抑制劑組平均光密度值僅有數值降低但差異無統計學意義（P>0.05）;與按法組和按法+溶劑組相比，按法+抑制劑組TRPV1平均光密度值降低（P<0.05）。（2）與空白組相比，模型組NO 和eNOS含量增高（P<0.05）;與模型組相比，按法組、按法+抑制劑組和按法+溶劑組的NO和eNOS含量增高（P<0.05）;與按法組和按法+溶劑組相比，按法+抑制劑組的NO和eNOS含量降低（P<0.05）。（3）與空白組相比，模型組5-HT含量增高（P<0.05）;與模型組相比，按法組、按法+抑制劑組和按法+溶劑組的5-HT含量降低（P<0.05）;與按法組和按法+溶劑組相比，按法+抑制劑組的5-HT含量升高（P<0.05）。結論 按法刺激激痛點產生去活化效應，其機制可能與激活TRPV1受體、上調eNOS和NO含量、降低5-HT含量有關。

〔關鍵詞〕 推拿;按法;激痛點;辣椒素受體1;一氧化氮;內皮型一氧化氮合酶;五羥色胺

〔中圖分類號〕R244? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.013

Effect of Local Pressing Stimulation on TRPV1 of Myofascial Trigger Point in Rats

YUAN Yuan， JIANG Quanrui， WU Qiong， ZHU Xiaoqing， KUANG Xiaoxia， JIANG Yuting， LI Tielang*， LI Wu*， LI Jiangshan

（Tui-na Teaching and Research Office， College of Acupuncture & Moxibustion and Tui-na， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate whether transient receptor potential vanillic acid subtype 1 （TRPV1） could be activated by stimulation of myofascial trigger point （MTrP） by the pressing and to preliminary explore the mechanism of analgesia by pressing. Methods 60 SD rats were randomly divided into blank group （n=10） and model-establishment group （n=50）. The blank group did not carry out modeling and intervention， but only fed normally. In the model-establishment group， the model of MTrP was established by local hitting combined with eccentric running. After the evaluation of the model， the model rats were randomly divided into model group， pressing group， pressing + inhibitor group and pressing + solvent group， with 10 rats in each group. The model group did not intervene. The pressing group was given local pressing treatment. Pressing + inhibitor group was given intraperitoneal injection of capsaicin solution （TRPV1 inhibitor） and local pressing treatment. The pressing + solvent group was given intraperitoneal injection of solvent and local pressing treatment. The pressing operation was carried out by a self-made pressing instrument. After sampling， the TRPV1 was detected by immunohistochemical method. The endothelial nitric oxide sgnthase （eNOS）， nitric oxide （NO） and 5-hydroxytryptamine （5-HT） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Results （1） Compared with the blank group， the average optical density of TRPV1 in the model group was significantly higher （P<0.05）. Compared with the model group， the average optical density of TRPV1 in the pressing group and pressing + solvent group increased （P<0.05）， while the average optical density of the pressing + inhibitor group was only decreased， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. （2） Compared with the blank group， the content of NO and eNOS in the model group increased （P<0.05）. Compared with the model group， the content of NO and eNOS in the pressing group， pressing + inhibitor group and pressing + solvent group increased （P<0.05）. Compared with the pressing group and pressing + solvent group， the content of NO and eNOS in the pressing + inhibitor group decreased （P<0.05）. （3） Compared with the blank group， the content of 5-HT in the model group was significantly higher （P<0.05）. Compared with the model group， the content of 5-HT in the pressing group， pressing + inhibitor group and pressing + solvent group decreased （P<0.05）. Compared with the pressing group and the pressing + solvent group， the content of 5-HT in the pressing + inhibitor group was increased （P<0.05）. Conclusion The deactivation effect of MTrP by the pressing may be related to the activation of TRPV1 receptor， up-regulation of eNOS and NO content and decrease of 5-HT content.

〔Keywords〕 massage; pressing; myofascial trigger point; transient receptor potential vanillic acid subtype 1; nitric oxide; endothelial nitric oxide synthase; 5-hydroxytryptamine

肌筋膜激痛點（myofascial trigger point， MTrP），又叫扳機點、觸發點，是骨骼肌緊繃肌帶內高度敏感的應激點，根據是否伴有自發性疼痛，可分為活性激痛點與隱性激痛點，隱性激痛點無自發疼痛，但是肌肉損傷、疲勞和營養缺乏等均可使MTrP活化，產生疼痛、活動受限、感覺異常和自主神經紊亂等癥狀[1]。激痛點相關癥狀易發易反復，頸肩腰腿等部位為高發區域，嚴重時導致抑郁、焦慮和睡眠障礙，大大降低生活質量[2]。

激痛點相關疼痛的藥物治療包括肌肉松弛劑、抗炎藥和鎮痛藥等[3]，但長期療效不理想，且易產生不良反應。中醫學認為激痛點屬于“筋結”范疇，其痛癥屬于“經筋病”，以“以痛為腧”為治療大法[4]，即對激痛點局部進行針刺或點按彈撥等刺激。臨床實驗[5]證實，按壓可以使MTrP去活化，緩解疼痛，但其作用機制不明確。目前，認為微循環障礙和致痛物質釋放是MTrP形成機制中的重要環節[6]。有研究[7]表明，辣椒素受體1（transient receptor potential vanillic acid subtype 1， TRPV1）激活后可以通過激活內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide sgnthase， eNOS）的途徑增加一氧化氮（nitric oxide， NO）釋放，改善局部微循環。本研究擬建立慢性大鼠激痛點模型，對大鼠激痛點進行按法干預，并加入TRPV1抑制劑作為對照，檢測組織中TRPV1、eNOS、NO和五羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）表達，探索按法刺激激痛點是否與激活TRPV1有關，從而揭示按法治療激痛點相關疼痛的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物與分組

SPF級健康SD大鼠60只，雄性，體質量180～200 g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK（湘）：2019-0009。飼養溫度24～26 ℃，濕度50%～70%。實驗方案中動物倫理的問題由湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會討論并批準通過。60只大鼠隨機分為空白組10只和造模組50只?？瞻捉M不進行造模和干預操作，僅正常飼養;造模組經造模評價成功后，選取40只成模大鼠隨機分為模型組、按法組、按法+抑制劑組和按法+溶劑組，每組10只。

1.2? 主要試劑與儀器

呼吸麻醉機（深圳瑞沃德，型號：R500通用型）;跑步機（金華市宇晟運動，型號：C100型）;按法治療儀與擊打器（自制）;超微量分光光度計（Thermo，型號：NanoDrop2000型）;瑞士帝肯IF50酶標儀（瑞士帝肯，型號：IF50型）;辣椒平（MedChemExpress，貨號：HY-15640）;異氟烷（深圳瑞沃德，貨號：R510-22）;4%多聚甲醛溶液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G1101-500ML）;TRPV1多克隆抗體（北京博奧森，貨號：BS-23926R）;山羊抗兔IgG聚合物（北京中杉金橋，貨號：PV-9001）;大鼠NO ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A013-2-1）;大鼠eNOS ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：H195）;大鼠五羥色胺 ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：H104）。

1.3? 動物模型建立

造模參考黃強民團隊改良并驗證的離心運動結合鈍性打擊法[8]，分為適應期、造模期和恢復期，其中，適應期1周、造模期8周、恢復期4周，具體如下。經過評價，滿足觸診和肌電評價造模成功共計42只。

1.3.1? 適應期? 所有大鼠在造模前，在實驗跑臺內進行實驗前訓練，即跑臺-16°水平放置下，大鼠訓練跑15 min，持續1周，使大鼠熟悉環境。

1.3.2? 造模期? 造模期每周第1天進行鈍性打擊，采用異氟烷呼吸麻醉大鼠后，固定于打擊器底端，打擊器的鈍性木棒從20 cm高度落下，打擊大鼠左側股內側肌標記位置，動能為2.352 J。打擊前由有經驗的臨床醫師對大鼠進行觸診，確定大鼠股內側肌位置并標記，每次打擊位置均為該標記位置。第2天進行離心跑臺，將小動物跑臺設置在-16°下坡跑模式，跑臺速度為16 m/min，對需要造模的所有大鼠進行離心運動訓練，在跑臺過程中通過機械刺激與聲音刺激等方式驅趕大鼠，保證完成連續90 min的離心運動。其余5 d時間正常喂養，不作干預，持續8周。

1.3.3? 恢復期? 不進行任何處理，每天正常喂養大鼠，正常活動，持續4周?；謴推跒榇笫蠹ね袋c能否穩定存在的一個重要因素，排除急性損傷對實驗的影響。

1.3.4? 模型評價? 造模評價方法參考黃強民團隊的標準[8]，即以觸診結合肌電的方法，具體操作為：觸摸鈍性打擊點肌肉，存在明顯的緊張帶，在緊張帶上尋找膨大結節，用電極插入膨大結節內能引出局部抽搐反應，肌電檢測出自發電位，則提示激痛點模型形成。

1.4? 激痛點定位和干預方法

1.4.1? 激痛點定位? 根據鈍性打擊點，先用手觸摸確定緊張帶位置，再在緊張帶上尋找硬結，用指甲掐按大鼠有抽搐反應。

1.4.2? 按法操作? 選用自制的中醫按法刺激儀器[9]操作。將實驗大鼠仰臥位放置固定，操作部位局部備皮，自制的儀器按照前期研究[10]調整好參數（力量0.7 kg、時間7.5 min、頻率10次/min），在相應的激痛點上進行按壓刺激。

1.4.3? 干預方法? 模型組不進行干預;按法組給予局部按法治療（參數如“1.4.2”，2 d/次，一共7次，共計14 d）;按法+抑制劑組給予腹腔注射辣椒平溶液（辣椒平粉末溶于10% Tween80+10% DMSO+80%生理鹽水，10 mg/kg，2 d/次，在按法操作前30 min進行）和按法（同前）治療;按法+溶劑組給予腹腔注射溶劑和按法（同前）治療。

1.5? 組織標本采集和處理

治療與檢測結束后，空氣栓塞法處死大鼠，再對標記激痛點處進行肌肉組織取材，將組織置于預冷生理鹽水中，并用生理鹽水清洗血跡，洗滌3次以上盡可能減少殘留血液，濾紙吸干，以-80 ℃冰箱或4%多聚甲醛保存。

1.6? 指標檢測

1.6.1? TRPV1含量檢測? 采用免疫組化法檢測。激痛點組織取材后沖洗固定，石蠟切片脫蠟至水，置于盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液（pH 6.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，放入3%雙氧水溶液阻斷內源性過氧化物酶，滴加3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，加一抗和二抗，DAB顯色，蘇木素復染脫水封片。拍攝并通過Image-Pro Plus 6.0觀察分析其平均光密度值。

1.6.2? 組織eNOS、NO和5-HT含量測定? 采用酶聯免疫吸附法測定。按照說明書要求操作，制備組織勻漿液樣本。室溫平衡后取出板條，按要求加樣設置標準品孔和樣本孔，按要求滴加各步驟需要的試劑、37 ℃水浴孵育和洗板。在450 nm波長測定各孔的OD值，繪制出標準品線性回歸曲線并計算各樣本濃度值。

1.7? 統計學方法

所有數據均使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料以“x±s”表示，進行正態性、方差齊性檢驗：滿足正態性者，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時選擇LSD法，方差不齊時選擇Dunnett T3法;不滿足正態性時選擇秩和檢驗。均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 各組大鼠激痛點組織TRPV1平均光密度值比較

與空白組相比，模型組、按法組和按法+溶劑組TRPV1平均光密度值增高，差異有統計學意義（P<0.05）;按法+抑制劑組平均光密度值無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組相比，按法組和按法+溶劑組TRPV1平均光密度值增高，差異有統計學意義（P<0.05）;按法+抑制劑組平均光密度值僅有數值降低，差異無統計學意義（P>0.05）。與按法組、按法+溶劑組相比，按法+抑制劑組平均光密度值降低，差異有統計學意義（P<0.05）。按法組與按法+溶劑組平均光密度值比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、圖1。

2.2? 各組大鼠激痛點組織NO、eNOS和5-HT含量比較

與空白組相比，模型組、按法組、按法+抑制劑組和按法+溶劑組的NO、eNOS、5-HT含量均增高，差異均有統計學意義（P<0.05）;與模型組相比，按法組、按法+抑制劑組和按法+溶劑組的NO、eNOS含量增高，5-HT含量降低，差異均有統計學意義（P<0.05）;與按法組和按法+溶劑組相比，按法+抑制劑組的NO、eNOS含量降低，5-HT含量增高，差異均有統計學意義（P<0.05）;按法組和按法+溶劑組的NO、eNOS、5-HT含量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

慢性MTrP是急性損傷繼發局部供能障礙所致的一種慢性肌肉病變結構，“能量危機學說”[11]認為，慢性勞損導致肌肉運動終板功能障礙，神經末梢ACh過度釋放，使肌纖維膜持續去活化，肌質網Ca2+通道開放釋放Ca2+，同時，損傷導致肌細胞膜機械性破裂，細胞外Ca2+內流，使得細胞內Ca2+濃度升高，肌纖維收縮。攣縮肌節壓迫局部血管，導致微循環障礙，產生能量危機，其產生疼痛的重要因素之一是缺血缺氧導致周圍的神經血管反應物大量釋放敏化此區域的致痛物質（如5-HT和P物質等）刺激感覺神經[12]。

5-HT廣泛存在于哺乳動物的組織中，但是其在中樞系統和外周系統的效應不同：在中樞系統中，5-HT作為一種重要的神經遞質，調節機體的心理與生理活動中，是多種生理、行為和認知功能的關鍵[13];在外周組織中，5-HT是一種強血管收縮劑和平滑肌收縮刺激劑，并參與疼痛信號的傳導，與痛覺過敏密切相關[14]。本實驗主要觀測5-HT在激痛點組織（外周）中的含量變化，實驗結果顯示，與空白組相比，模型組的5-HT含量較高（P<0.05），表明激痛點造模后，局部5-HT含量增加。這與既往的研究類似，即在疼痛模型大鼠中，組織局部5-HT含量上升[15]。此外，與模型組相比，按法組5-HT含量降低（P<0.05），這表明按法干預可以減少5-HT含量，也間接說明按法緩解激痛點相關疼痛的作用，即激痛點的去活化作用，與本課題組前期研究[16]一致。

TRPV1是存在于細胞膜上的一種非選擇性的配體門控性陽離子通道，是傷害性刺激的分子感受器，在傷害性刺激信息傳導過程中起著關鍵作用[17]。TRPV1參與了機體對刺激的感知、疼痛的傳遞以及鎮痛的機制，被認為是疼痛調節的關鍵受體[18]，在疼痛、炎癥、溫度覺、調節血管功能等方面有重要意義[19]，其能夠被炎癥、疼痛、辣椒素、機械壓力等體內多種因素激活。長時間激活TRPV1可以使內皮細胞舒張，改善內皮細胞和血管功能[20]。本實驗結果中，與空白組相比，模型組、按法組和按法+溶劑組的TRPV1平均光密度值增高（P<0.05），表明激痛點造模后，局部TRPV1受體含量增加。與模型組相比，按法組和按法+溶劑組的TRPV1平均光密度值增高（P<0.05）;與按法組和按法+溶劑組相比，按法+抑制劑組的TRPV1平均光密度值降低（P<0.05），表明按法刺激可以進一步上調TRPV1的表達，而TPRV1抑制劑可以部分抑制該作用。

研究[21]認為，激痛點局部組織循環灌注不佳，局部組織缺氧，出現氧耐量及氧適應降低的病理特點。在調節血液循環方面，TRPV1可以促使eNOS生成NO，NO促進cGMP與cAMP生成，進而舒張血管改善血液循環[22]。NO是一種內源性氣體分子，在人體內作為信號分子具有重要的生物學功能，包括調節血流和舒張血管，抑制血管平滑肌的增生和調節代謝活動等[23]。NO由NO合成酶（NOS）的3種亞型合成，即神經元型（nNOS或NOS1）、誘導型（iNOS或NOS2）和內皮型（eNOS或NOS3）[24]，調節NO可以改善局部組織微循環血流運行，從而調節局部組織血液與營養供應而改善其缺血缺氧病理狀態，促進能量代謝，修復損傷[25]。本實驗結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠NO與eNOS含量增高（P>0.05），這可能與激痛點造模后局部損傷組織應激性保護相關，與既往研究結果類似[26-27]。與模型組相比，按法組、按法+抑制劑組和按法+溶劑組的eNOS和NO含量增高（P<0.05）;與按法組和按法+溶劑組相比，按法+抑制劑組的eNOS和NO含量降低（P<0.05），表明按法刺激激痛點可以提高局部eNOS和NO含量，當同時運用TRPV1抑制劑時，可以部分抑制該作用。結合前述5-HT的變化趨勢：與按法組和按法+溶劑組相比，按法+抑制劑組的5-HT含量升高（P<0.05），即按法刺激激痛點可以降低局部5-HT含量，而同時使用TRPV1抑制劑可以部分阻斷該作用。

綜上所述，按法刺激激痛點可以減少5-HT的含量，在TRPV1被抑制情況下，該作用也被抑制。按法可以提高激痛點組織TRPV1、eNOS和NO含量，其中eNOS和NO與改善局部血液循環密切相關，當TRPV1被抑制時，eNOS和NO含量減少，這表明按法刺激激痛點可能是通過激活TRPV1實現其效應，即TRPV1是按法刺激激痛點的起效環節之一。

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