弱精子癥與健康可育男性精子miRNA 表達譜差異分析

梁高照，張國暉，李 春，汪 清（通訊作者）

（1 深圳市寶安人民醫院<集團>泌尿疾病中心 廣東 深圳 518000）

（2 廣東醫科大學 廣東 湛江 524000）

弱精子癥（asthenozoospermia, AZS）是指精子前向運動（a 級+b 級）小于32%的病理狀態，是男性不育的主要原因之一[1]。健康可育男性精子microRNA,（miRNA）是一類小的、單鏈的非編碼RNA 分子，是基因表達中的一類調控因子。在精子發生過程中，miRNA 以細胞特異性方式表達，參與男性生殖細胞分化的每個步驟[2]。研究表明，miRNA 表達失調會導致AZS，是AZS形成的重要原因[3-5]。然而，由于實驗對象、年齡、實驗方法或miRNA 參考范圍存在差異，各個研究中心之間關于AZS 的miRNA 的研究數據及表達譜仍然存在很大差異。鑒于miRNA 調控在AZS 發生中的重要作用及各研究中心之間關于miRNA 表達譜的參差不齊，旨在鑒定和表征AZS 不育男性和健康可育男性精子中的miRNA 表達譜，并進一步探討miRNA 靶基因的功能聚類及控制通路，預測miRNA 在AZS 發生中的分子機制。

1.資料與方法

1.1 一般資料

于2018 年12 月—2019 年11 月，選取因不孕不育到深圳市寶安區人民醫院泌尿外科就診的年輕男性。（1）AZS 不育組納入標準：25 ～40 歲男性；精液實驗室檢查符合AZS 世界衛生組織（World Health Organization WHO）診斷標準：活力PR 級（a+b 級）＜32%、精子濃度≥15×106/mL、正常精子形態≥4%；未育；性激素水平正常；生殖系統體格檢查正常。（2）正常對照組納入標準：25 ～40 歲男性；精液實驗室檢查正常：PR 級（a+b 級）≥32%、精子濃度≥15×106/mL、正常精子形態≥4%；具有健康子代。（3）排除標準：精液異常（顏色、體積、液化異常）、精漿果糖異常、α-葡糖糖苷酶異常、泌尿生殖道感染。納入的所有男性均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本收集 所有男性禁欲5 d 后收集精液，常溫下液化。采用SCA 全自動精液質量分析儀對樣本進行常規分析。分析所有精液樣本的參數，包括體積、液化時間、pH、精子數量、精子活力、精子密度和形態。液化后立即在-80℃冰箱下保存。

1.2.2 樣本總RNA 提取及質量檢測 精液樣品解凍，分離精漿，純化精子。總RNA 提取方法參照RNA 提取試劑盒（invitrogen，美國）使用說明。采用Nanodrop 超微量核酸蛋白檢測儀測定所提取的總RNA 濃度。1%的瓊脂凝膠電泳檢測RNA 樣本質量。篩選滿足條件的RNA 樣本保存于-80℃冰箱。

1.2.3 MiRNA 文庫構建 按照QIAseqTM miRNA Library Kit 說明書進行文庫制備，文庫制備完成后，對文庫質量進行檢測，確保文庫有效濃度＞2 nmol/L。在HiSeq-2000 系統上進行測序。通過HiSeq 控制軟件進行實時分析和堿基識別。

1.2.4 小RNA 序列分析

測序下機后，分析原始數據，并刪除低質量的reads。修剪3'銜接子序列后，使用miRDeep2 以默認參數從所有文庫中提取長度大于17 nt 的小RNA 讀數，以識別已知的和新穎的miRNA[6]。每個庫分別處理。

1.2.5 靶基因預測和信息深度分析 通過miRTarBase 數據庫預測差異表達miRNA 的靶基因。為了全面描述基因和基因產物的特性，我們采用topGO（version 2.18.0）從分子功能、生物過程和細胞組成三個方面進行了基因本體（gene ontology, GO）注釋和富集分析，采用KOBAS（kobas2.0-20150126）[7]對篩選到的差異基因進行KEGG PATHWAY 富集分析，挖掘差異表達miRNA 靶基因參與的主要功能及生化代謝途徑。

1.3 統計學方法

2.結果

2.1 一般資料

使用SCA 全自動精液質量分析儀對不育組35 例AZS不育患者精液樣本和36 例健康對照組精液樣本進行精液常規分析。收集并分析組間樣本參數，發現組間樣本在年齡、精液體積、pH、液化時間、精子密度、精子畸形率方面無統計學差異（P＞0.05）。但弱精癥組精子前向運動率明顯低于正常對照組，具有統計學差異（P＜0.05），見表1。

表1 兩組精液樣本參數比較（ ± s）

表1 兩組精液樣本參數比較（ ± s）

注：aP ＞0.05，bP ＜0.05。

項目 不育組（n=35） 對照組（n=36）年齡/歲 33.48±1.716a 30.33±1.871體積/mL 4.33±0.943a 4.33±0.471 pH 7.59±0.162a 7.49±0.067液化時間/min 25.00±2.454a 26.67±2.491密度/（106?mL-1） 87.82±4.451a 86.27±2.658活力/%（a+b） 24.05±1.232b 69.42±5.977畸形率/% 73.90±4.374a 75.63±3.027

2.2 RNA 純度和濃度

使用Nanodrop 超微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA 純度和濃度，結果顯示大部分樣本所提取的RNA 濃度均處于較低水平；瓊脂凝膠電泳檢測RNA 質量發現RNA條帶不清晰。RNA 樣本篩選閾值設定為：RNA 濃度大于80 ng/μL、1.8 ＜OD260/OD280 ＜2.0 且RNA 電泳圖條帶清晰。僅有7 個樣本（不育組4 例和對照組3 例）滿足上述篩選標準，納入測序實驗，見表2。

表2 兩組樣本RNA 濃度和純度比較

2.3 基因表達豐度統計

基因表達定量用TPM 作為單位，即每百萬reads 中來自某一基因的reads 數[10]。對數據進行統計后得到如下的TPM 分布箱式圖，見圖1。

圖1 TPM 分布箱式圖

2.4 miRNA 差異表達譜

采用二代測序平臺對樣本進行測序，然后采用edgeR分析miRNA 的表達水平。本次分析中差異基因的篩選主要從差異倍數和顯著水平兩方面進行評估，篩選閾值設定為：|log2（FoldChange）|＞1 且FDR ＜0.01。結果表明，共有16 個miRNA 的表達改變具有統計學意義，其中10 個miRNA 表達下調，6 個miRNA 表達上調，見表3。MiR-34c 在弱精癥組中表達水平明顯下調，具有最顯著的表達差異（FDR=9.15×10-5）；miR-34b表達水平同樣下調，且表現出了最大倍數變化（|log2（FoldChange）|＞4）。我們對不育組和對照組差異表達的16 個miRNA 的相互關系進行分層聚類。觀察到2 個不同的簇團，弱精癥組與正常對照組差異表達的miRNA 分別聚類。通過對差異表達的16 個miRNA 的靶基因進行預測，發現了這些miRNA參與了9 744 個靶基因的調節，見表3。

表3 符合篩選標準的miRNA

2.5 miRNA 靶基因信息學分析

為了更好地了解這些miRNA 的潛在含義，對目標基因進行了GO 富集分析和KEGG Pathway 富集分析，以評估其潛在功能。GO 分析結果表明，miRNA 靶基因顯著富集于不同功能組（P＜0.05）。這些差異表達的miRNA靶基因參與細胞代謝過程、RNA 生物合成過程的調控、RNA 代謝過程的調控、生物合成過程的調控等生物過程，參與了細胞器、細胞質、細胞核等細胞成分；參與蛋白質結合、DNA 結合、轉移酶活性、酶結合等分子功能調節。我們分別對上調的6 個miRNA 的靶基因和下調的10 個miRNA 的靶基因進行GO 富集分析，也得出和上訴基本一樣的結論。KEGG Pathway 富集分析結果表明miRNA 靶基因明顯富集于90 個KEGG 途徑（P＜0.05）,涉及的代謝通路非常廣泛。MiRNA 調節的最活躍的代謝途徑包括癌癥中的microRNA、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、慢性粒細胞白血病、膠質瘤、大腸癌、內分泌抵抗、前列腺癌、細胞衰老、乙型肝炎、癌癥中的蛋白聚糖，見圖2。

圖2 差異表達基因KEGG 富集散點圖

3.討論

24%的不育男性因各種因素（精索靜脈曲張、感染或遺傳原因）而出現孤立的AZS[11-13]。然而，許多AZS病例在本質上是特發性的，并且不能將具體原因歸因于該病癥[14]。因此，需要進一步研究以更好地了解影響精子前向運動力的因素，以治療/管理此類病例。精子發生是一個復雜過程，涉及眾多miRNA 的精細調控。既往已經有部分文獻表明miRNA 失調與AZS 相關[3-5]。

共收集了35 例AZS 不育男性精液樣本和36 例健康可育男性精液樣本。然而，在檢測RNA 質量時，結果顯示，絕大部分樣本（64 例）RNA 濃度偏低，無法建庫進行測序。經過分析，我們認為原因可能包括以下幾點：（1）精子細胞RNA 含量極低，約為體細胞RNA 的1/100[15]；（2）精子RNA 主要存在于致密的細胞核及核周圍[16]，大大增加提取難度；（3）RNA 自身結構中尚存在2 個游離的羥基，容易進攻自身的肽鍵；（4）RNA 是單鏈結構，極不穩定，在樣本液化、儲存、及實驗過程中非常容易受外界環境（溫度、RNA 酶、儲存時間）影響，導致發生不同程度的降解，降低RNA 含量。由此可見，提取精子RNA 的難度相對較大，對實驗設計及環境要求比較嚴格。從以上原因，我們認識到在涉及精子RNA 的實驗中，我們應該優化實驗方案，改善實驗條件，避免儲存過長時間，嚴格在低溫條件下進行操作，盡量減少RNA降解[17]。

通過下一代測序平臺評估了AZS 不育男性和正?？捎行缘木硬町惐磉_的miRNA 譜。我們的實驗數據和Abu-Halima 等[17]以及Salas-Huetos 等[3]的研究結果吻合，比如miR-34b 和miR-143 在AZS 患者中均存在表達失調。更重要的是，我們還發現了很多之前未曾報道與AZS 相關的miRNA，極大地豐富AZS 中的miRNA 差異表達庫，為后續研究miRNA 調控AZS 發生的生物學機制提供了新的方向。相較于健康對照組，AZS 不育患者中miR-34c 表達明顯下降，表現出較大的表達倍數變化，且具有最顯著的統計學差異。我們認為miR-34c 在AZS中具有巨大的潛在作用，有希望成為AZS 的診斷性生物標志物和治療的生物靶點。

為了進一步了解和提供一些分子信息，以了解AZS 涉及這些miRNA 的生理功能和生物學過程，基于miRNA/mRNA 的相互作用原理預測了靶基因。GO 和KEGG功能注釋結果表明，miRNA 靶基因的代謝途徑涉及范圍十分廣泛。由此可見，在參與AZS 發生過程中，miRNA的生物學調節機制被整合于多個途徑中，通過多種信號傳導途徑調節多種基因表達。廣泛的靶標范圍及作用途徑充分表明這些miRNA 可能在AZS 發生的生物學調控中起著至關重要的作用。

本文對象是青壯年不育男性，文中尚未明確不同年齡組的miRNA 表達譜是否存在差異，有待進一步明確。

綜上所述，AZS 不育男性和健康可育男性的精子miRNA 存在著不同的表達譜，同時也豐富了AZS 的miRNA表達譜，miR-34c 有望成為AZS 的生物標志物和治療靶點。miRNA 靶基因顯著富集于多個生物學通路中，通過多種信號通路影響精子的發生，導致AZS。