黃綠青霉素對神經細胞PC-12損傷作用的研究

楊 菁，曹羅元，董文婿，林應華，黃寶英，富顯果*

(1.寧德師范學院附屬寧德市醫院 細胞分子生物學實驗室,福建 寧德352100；2.福建省病原真菌與真菌毒素重點實驗室(福建農林大學)，福建 福州350002)

黃綠青霉素(CIT)是由于大米、玉米等糧食作物和飼料發霉而產生的一種具有很強生物活性的次級代謝產物，主要由黃綠青霉菌、赭鮭色正青霉菌及土霉菌產生[1-2]。世界上有許多國家和地區以大米為主要糧食，不當的儲存條件如潮濕、時間過長會導致黃綠青霉菌迅速生長，產生大量的CIT。據聯合國糧食及農業組織(FAO)估計，全球約有1/4-1/3的谷物受到真菌毒素的污染，飼料污染的情況則更為嚴重[3]，CIT是造成污染的真菌毒素之一，因此，這是一個不可忽視的公共衛生問題。毒理學研究表明，CIT對人和動物(包括小鼠、大鼠、兔子等)有急性神經毒性作用，如體溫降低、呼吸衰竭、循環衰竭、麻痹和抽搐等[4]，但其具體作用機制并不明確。目前，氧化應激反應被認為是神經細胞結構或功能損傷的重要誘因，常常與某些神經性疾病病因相關[5]。已有的研究中，Yuntao Bai[6]等人通過檢測細胞內活性氧(ROS)和還原型谷胱甘肽(GSH)的生成，證實了CIT能夠誘導人肝源性肝癌細胞株HepG2細胞的DNA損傷，最有可能是通過氧化應激機制進行的。因此，本研究通過將CIT作用于神經細胞PC-12，檢測細胞活性及相應的氧化應激指標，明確黃綠青霉素是否通過氧化應激機制損傷神經細胞。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

二氧化碳培養箱(Thermo、BB15)，全波長酶標儀(Molecular Devices、SPECTRA MAX 190)，低溫高速離心機(Beckman、Allegra X-22R)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS、IX71)。

黃綠青霉素(純度≥97%，貨號ALX-630-118-M001，購于ENZO公司)，MEM培養基、胎牛血清(FBS)、PBS緩沖液(Hyclone)，胰酶(Gibco)，CCK-8試劑盒、脂質氧化(MDA)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、一氧化氮(NO)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、NP-40裂解液(碧云天)，ROS試劑盒、GSH試劑盒、SOD檢測試劑盒(南京建成)。

1.2 細胞培養和分組

PC-12細胞(鼠腎上腺嗜鉻細胞)，購于中國科學院細胞庫。PC-12細胞用含10%FBS的MEM培養基常規培養至對數生長期，加入CIT，除LDH檢測采用無血清培養基加CIT，其余實驗均用含10%FBS的培養基加CIT，共培養時間均為 24 h，參照Yuntao Bai[6]與Yuexia Wang[7]，將實驗分為四組：低劑量組(CIT濃度2.5 μmol/L)，中劑量組(CIT濃度5 μmol/L)，高劑量組(CIT濃度10 μmol/L)，空白對照組用DMSO處理，倒置顯微鏡下觀察細胞形態的變化。

1.3 CCK-8法檢測細胞活性

將PC-12細胞濃度調整為5×107個/L，每孔100 μl接種至96孔板，培養24 h后細胞貼壁，加入不同濃度CIT再共培養24 h。檢測時加入10 μl CCK-8溶液，放置培養箱內孵育1 h，450 nm測吸光度。對照組存活率設為100%，藥物組存活率=測定OD值/對照OD值。

1.4 LDH釋放率檢測

PC-12細胞濃度為5×107個/L，每孔100 μl接種至96孔板，24 h后細胞貼壁，吸去培養液，用PBS洗一次。換成200 μl無血清培養液，加入不同濃度CIT，共培養24 h。到檢測時間前1 h，在“樣品最大酶活性對照孔”中加入20 μl LDH釋放試劑，混勻后繼續在細胞培養箱中孵育。到達檢測時間，取細胞培養液在400 g離心5 min。每孔取上清液120 μl，加到新的96孔板，各孔分別加入60 μl LDH檢測工作液，混勻，室溫避光孵育30 min。490 nm處測定吸光度，600 nm作為參考波長進行雙波長測定。LDH釋放率=(樣品孔OD值-背景空白對照孔OD值)/(最大酶活性對照孔OD值-最大酶活性空白孔OD值)，ΔLDH 釋放百分率=樣品組LDH 釋放百分率-空白對照組 LDH 釋放百分率。

1.5 MDA、ROS、NO含量檢測

PC-12細胞接種至六孔板，每孔細胞數1×106個，每孔2 ml培養基，培養24 h待細胞貼壁后，加入不同濃度CIT共培養24 h。細胞培養液1 500 g離心5 min，取上清液加入MDA檢測試劑混勻，沸水浴15 min，532 nm測吸光度，計算MDA含量。

培養液換成2 ml無血清培養基，一組正常培養的細胞不加探針，只加培養基設為陰性對照，一組正常培養的細胞加入供氫體(終濃度24 μmol/L)設為陽性對照孔，所有孔都加入DCFH-DA探針(終濃度10 μmol/L)，37℃培養箱孵育30 min到1 h，吸去培養液，加入PBS將細胞吹打下來，再用PBS洗1-2遍，離心去上清收集沉淀，按照FITC熒光檢測條件檢測ROS熒光值。

細胞濃度為5×107個/L，每孔100 μl接種至96孔板，貼壁生長24 h后，加入不同濃度CIT，共培養24 h。取細胞培養液在400 g離心5 min。每孔取50 μl在新的96孔板中加入標準品及樣品，然后加入檢測試劑，在540 nm處測吸光度，根據標準品曲線計算出樣品中NO的濃度。

1.6 GSH含量、SOD活力的檢測

PC-12細胞接種至六孔板，每孔細胞數1×106個，每孔2 ml培養基，培養24 h待細胞貼壁后，加入不同濃度CIT共培養24 h。棄去培養液，用冰浴過的PBS洗3遍，加入NP-40裂解液(PMSF終濃度為1 mM)，4℃裂解30 min，4℃下3 500 g離心10 min，取100μl上清液按照GSH檢測試劑盒說明書，420 nm處測定吸光度，用BCA蛋白定量試劑盒定量，GSH含量(μmol/gprot)=(樣品孔OD值-空白孔OD值)/(標準孔OD值-空白孔OD值)×標準管濃度(20 μmol/L)×樣本前處理稀釋倍數(2)÷待測樣本蛋白濃度(gprot/L)。

按照SOD檢測試劑盒說明書，450 nm處測定吸光度，SOD 抑制率(%)=[(對照孔OD值-對照空白孔OD值)-(樣品孔OD值-樣品空白孔OD值)]/(對照孔OD值-對照空白孔OD值)×100%，SOD活力(U/mgprot)=SOD 抑制率÷50%×反應體系稀釋倍數(0.24 ml/0.02 ml)÷待測樣本蛋白濃度(mgprot/mL)。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 黃綠青霉素對細胞形態的影響

CIT處理PC-12細胞24 h后，細胞出現聚集現象。隨著CIT濃度的增大，細胞聚集成團的程度也越高，并開始脫落，出現空斑，而對照組未出現明顯變化。見圖1。

圖1 黃綠青霉素對PC-12細胞形態的影響(×100)

2.2 CIT抑制細胞活性

隨著CIT濃度的增大，細胞活力明顯下降，呈現劑量效應關系，所有的CIT組與對照組相比，差異均具有統計學意義(P<0.01)，說明CIT能夠明顯抑制細胞活性。見圖2。

圖2 CIT對細胞活性的影響

2.3 CIT對LDH釋放率的影響

與對照組相比，所有CIT處理組的LDH釋放率均明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 CIT對LDH釋放率的影響

2.4 CIT對MDA、ROS、NO含量的影響

與對照組相比，CIT組的MDA含量均顯著升高(P<0.01)，見圖3；ROS含量均比對照組顯著升高，在2.5 μmol/L和5 μmol/L組中效果極為顯著(P<0.01)，10 μmol/L組中效果較為顯著(P<0.05)，見圖4；隨著CIT濃度增大，細胞外的NO含量下降，呈劑量效應關系。與對照組相比，2.5 μmol/L組及5 μmol/L組下降顯著(P<0.05)，10 μmol/L組下降的極為顯著(P<0.01)，見圖5。

圖3 CIT對MDA含量的影響

圖4 CIT對 ROS含量的影響 圖5 CIT對NO含量的影響

2.5 CIT對GSH含量、SOD活力的影響

細胞內的GSH含量隨CIT濃度增大呈下降趨勢，在2.5 μmol/L和5 μmol/L組中效果不顯著(P>0.05)，10 μmol/L組中效果顯著(P<0.05)，見圖6。

圖6 CIT對GSH含量的影響 圖7 CIT對SOD活力的影響

細胞內的SOD活力隨CIT濃度增大而上升，各組與對照組比較均有極顯著差異(P<0.01)，2.5 μmol/L組、5 μmol/L組與10 μmol/L組之間比較無明顯差異(P>0.05)。見圖7。

3 討論

本研究采用LDH法檢測黃綠青霉素對神經細胞的毒性作用，LDH在胞漿內含量豐富，正常時不能通過細胞膜，只有在細胞受損傷或死亡時才被釋放到細胞外，細胞培養液中LDH活性與細胞死亡數成正比。因此，LDH釋放被看做細胞膜完整性的重要指標，被用于細胞毒性檢測。當ΔLDH 釋放百分率≤20%，表明存在細胞輕度損傷，當ΔLDH釋放百分率為20%-50%時則為細胞中度損傷，而當ΔLDH釋放百分率≥50%時，則表明存在細胞重度損傷[8]。結合CCK-8結果，提示CIT對細胞有明顯的損傷作用，并能夠抑制細胞活性。

氧化應激反應是由于自由基過度產生無法及時清除，體內氧化與抗氧化作用失衡，導致機體的細胞和組織被損傷[9]，是應激性損傷的主要機制之一[10]。MDA是重要的氧自由基代謝產物，自由基作用于脂質發生過氧化反應，其氧化最終產物就是MDA，因此，MDA的含量可反映機體脂質過氧化的程度，間接反應細胞損傷的程度。ROS是有氧代謝的副產物，正常狀態下，ROS的產生與消耗處于平衡狀態[11]。但當機體受到各類有害刺激時，機體內ROS生成量增加，從而與體內抗氧化體系發生持續失衡，導致組織損傷[10]。

NO是一種反應性極強的自由基，起到神經遞質和信號分子的作用，能夠反應氧化應激的水平，參與多種生理和病理過程[12]。在合成NO的過程中，電子從一個單二聚體上的黃素還原酶結構域轉移到另一個單二聚體的氧化酶結構域，后者包含一個鐵結合血紅素活性位點。在血紅素位點，電子被用來還原和激活O2，O2又氧化生成NO，這個過程需要結合四氫生物蝶呤(BH4)進行偶聯，ROS可使BH4氧化導致解偶聯，使O2轉化為超氧化物自由基，降低NO生成量[13]。本研究結果表明，CIT能顯著提高細胞外MDA含量，在CIT濃度為5 μmol/L后，MDA含量就基本不變，這提示了CIT在低劑量就能夠引起脂質氧化；流式細胞儀檢測結果表明CIT顯著提高細胞內ROS含量，說明CIT能夠引起細胞氧化體系失衡；CIT會降低細胞外NO含量，進一步提示可能因為ROS含量增多引起的NO減少。

目前機體對抗氧自由基主要依賴自身的抗氧化酶系統，其中 SOD 和 GSH 是機體主要的抗氧化酶[14]。GSH能夠與體內的自由基結合使其轉化為代謝的酸類物質，同時也可以加速自由基的排泄和保護器官避免受到損傷[15]。SOD 能夠維持細胞膜的正常結構和功能，通過歧化作用降低體內過多的氧自由基，減少脂質過氧化反應[16]，維持細胞內氧化和抗氧化平衡，SOD 活力的高低反映的是機體抗氧化應激的能力[17]。有研究報道，在氧化應激的刺激下，細胞內為了處理過量的ROS，SOD的合成量會上升[18]。本研究結果表明，CIT處理細胞后，GSH水平呈下降趨勢，并在高劑量時顯著下降；各劑量組SOD的活力均顯著升高，這些結果都提示了CIT能降低細胞清除自由基的能力。

4 結論

黃綠青霉素能夠抑制PC-12細胞活性，并降低LDH釋放率及NO含量，對細胞具有明顯毒性作用；細胞外的MDA、細胞內ROS水平和SOD活力顯著上升，細胞內GSH含量呈下降趨勢。因此，黃綠青霉素能夠誘導神經細胞發生氧化應激，其分子機制還有待進一步研究證實。