花青素對阿爾茲海默病關鍵藥理途徑的生物信息學分析及實驗驗證

羅連響 黃芳芳 吳銳劍 林浩雯 王渠 李曉玲 黃宇戈

（廣東醫科大學海洋醫藥研究院，湛江524023）

阿爾茲海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種重度、慢性、進行性神經退行性疾病，與記憶和認知障礙相關，是老年人癡呆最常見的原因，并可導致死亡［1-2］。據估計，截至2018年，全球約有5 000萬人患有AD，預計到2050年，AD患者人數將增加3倍以上，達1.52億［3］。迄今為止，AD的病理機制尚未明確，但β-淀粉樣蛋白（Aβ）和微管相關蛋白tau被認為是促進AD發生和發展的兩個重要因素，細胞外Aβ蓄積，神經纖維纏結以及神經元內tau蛋白病變是AD的重要病理學特征［4］。此外，AD還與突觸丟失、特定神經遞質減少、神經炎癥和神經元死亡等多種因素有關［5］。目前，由于AD發病機制復雜且尚未明確，藥物只能在一定程度上緩解AD癥狀，但治療效果不理想，且副作用大［6］。

花青素（cyanidin）是多酚類黃酮類化合物花色苷（anthocyanins）的主要成分之一，在各種花、果、種子和植物葉片中含量豐富，如櫻桃、藍莓、桑樹、黑接骨木等，并且因其在中樞神經系統中的神經保護作用而備受關注［7-9］。花青素的神經保護作用的關鍵機制之一是抑制氧化應激和神經炎癥。據報道，花青素可通過抑制內質網應激對Aβ25-35誘導的神經元細胞死亡產生保護作用，以及通過抑制人神經母細胞瘤細胞TLR4/NOX4下游NF-κB活性來減輕Aβ25-35誘導的神經炎癥［10-11］。此外，研究表明，攝入花青素可降低AD發生的風險［12-13］。因此，探索花青素治療AD的機制具有重要意義。

網絡藥理學是在大數據醫學研究的新模式下產生的，可構建多層次網絡模型，從網絡角度描述生物系統、藥物和疾病之間的復雜性，以高通量方式揭示小分子的調控原理［14-15］。而分子對接可從已知結構的受體（靶蛋白或活性位點）和配體出發，按照幾何互補、能量互補以及化學環境互補的原則，進行分子間相互作用識別并預測受體-配體復合物結構，闡明藥物的作用機理［16-17］。因此，本研究采用網絡藥理學方法分析花青素治療AD的相關靶點以及相關信號通路，并通過分子對接技術以及體外實驗對主要靶點進行進一步驗證，為花青素治療AD提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料鼠小膠質細胞BV2細胞購自American type culture collection（ATCC）；花青素購自MedChem Express（MCE）；DMEM培養基、胎牛血清（FBS）和0.25%Trypsin-EDTA（1X）購自Gibco；普通RIPA裂解液（組織/細胞）購自Solarbio；抗COX-2抗體購自Cell Signaling Technology（CST）；二氧化碳培養箱（型號FORMA STERI-CYCLE i160）購自美國Thermo Electron公司；超凈工作臺（型號SW-CJ-2D）購自蘇州凈化設備有限公司；超分辨激光掃描共聚焦熒光顯微鏡（型號FV3000）購自日本Olympus公司；Gel‐View 6000M多功能圖像工作站（型號GelView 6000M）購自廣州博鷺騰儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物靶點的收集在Pubchem數據庫［18］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）收集花青素（cyanidin）的相關信息，并將其結構的SDF文件保存，隨 后 導 入Swisstargetprediction平 臺［19］（http：//www.swisstargetprediction.ch/）上進行靶點預測。同時，在Chembl數據庫（https：//www.ebi.ac.uk/chembl/g/）和CTD數據庫（https：//ctdbase.org/）中收集花青素的靶點，去重整合后校正為人源靶點。

1.2.2 疾病靶點收集在OMIM數據庫（https：//omim.org）和Genecards數 據 庫［20］（http：//Gene‐cards.org）中搜索AD的相關靶點。為了提高靶點準確性，取兩個數據庫中收錄疾病靶點的交集作為疾病的靶點。

1.2.3 蛋白質互作網絡（PPI）構建以及核心靶點的篩選將藥物靶點和疾病靶點相互映射，隨后將獲得的交集靶點導入STRING平臺［21］（https：//stringdb.org/）進行PPI網絡構建，并將該網絡數據導入cytoscape3.7.2軟 件，利 用cytoHubba插 件，采 用MCC算法篩選出10個hub基因。

1.2.4 GO和KEGG富集分析將花青素和AD兩者 的 交 集 靶 點 導 入Metascape平 臺［22］（https：//metascape.org/）進行富集分析，所有結果富集倍數均大于1.5，P值均小于0.01具有統計學意義。在GO生物進程、GO分子功能以及GO細胞組分這三個類別中分別選取富集基因數最高的前15條GO通路進行展示。KEGG通路也根據富基因數排列，取前13條通路展示。此外，本研究重點關注了篩選出的hub基因的富集分析情況，在所有結果中，抽取出hub基因的富集通路進行展示。

1.2.5 分子對接和分子動力學研究分子對接是一個模擬小分子在大分子活性位點的對接姿勢從而預測親和力的過程，可用于評價藥物活性成分與藥物靶點結合能力［23-24］。因此，利用AutoDock4對花青素和靶點PTGS2進行分子對接研究。從Pubchem數據庫中獲取化合物花青素的SDF格式（CID：68247），然后使用ChemOffice構建化合物的3D結構保存為*mol2格式并使其能量最小化。靶點蛋白方面，從PDB數據庫［25］（http：//www1.rcsb.org/）中獲取PTGS2的3D結構PDB格式文件（PDB ID：3LN1），使用pymol2.3來除去靶點的水分子和使用AutoDock4來添加氫，再使用AutoDock4把化合物和靶點保存為pdbqt格式，隨后運用vina程序進行對接，最后使用ligplot2.23來生成2D相互作用力圖以及使用pymol2.3來分析對接后復合物的3D模式圖。對接后，利用分子動力學仿真模擬PTGS2和花青素的復合物，以檢測復合物的穩定性和靈活性。本研究使用GROMACS2018.1軟件包和gro‐mos54a7_atbff力場以及SPC216水模型來進行分子動力學模擬。為了保證模擬系統的總電荷中性，在系統中加入相應數量的鈉離子取代水分子進而形成合適尺寸的溶劑盒。然后將周期邊界條件（PBC）應用于系統的三個方向。利用gromos54a7_atb力場，從ATB網站［26］（http：//atb.uq.edu.au/）獲得花青素的力場參數。最初，整個系統50 000步的能量在300 k時被最小化（EM）。隨后通過位置約束的MD模擬，然后通過NVT（粒子的數目、體積和溫度恒定）和NPT（粒子的數目、壓力和溫度恒定），實現受體、配體和溶劑的平衡。最后，對體系的均方根偏差（RMSD）和原子位置的均方根波動（RMSF）進行分析，RMSD可通過反映體系里的分散程度進而反映復合物的穩定性，而RMSF則通過反映某一個原子相對于參考構象的結構變化，從而反映原子的自由度（靈活性）。

1.2.6 鼠小膠質細胞BV2細胞的培養和處理BV2細胞培養在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養基中，并于5%CO2的37℃培養箱中培養。將BV2細胞以1×105個/ml的密度接種于12孔板中過夜。第2天將細胞分為空白對照組，LPS組以及給藥組（5、10、20 μmol/ml花青素），給藥組先用花青素預處理0.5 h，0.5 h后在LPS組以及給藥組中加入250 ng/ml LPS共刺激24 h。

1.2.7 Western blot分析如1.2.6所示進行藥物處理后，將BV2細胞用RIPA裂解液裂解以收集細胞蛋白。將收集的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，置于轉膜儀轉膜。轉膜后分別孵育一抗抗體，4℃孵育過夜。第2天洗膜后加入稀釋（1∶4 000）的二抗，室溫孵育1 h。二抗孵育完成后，顯影儀顯影。最后使用Image J軟件通過光密度法對印跡進行定量分析。

1.2.8 免疫熒光法檢測PTGS2蛋白的表達提前1 d將BV2細胞鋪于6孔板，在鋪細胞之前將無菌的方形蓋玻片加入6孔板。第2天進行藥物處理，收樣時棄去培養基，用PBS洗3次，然后加入4%多聚甲醛（PFA）室溫固定20 min。棄掉PFA，用PBS在室溫浸洗3次，每次5 min。然后加5 00 μl 0.5%Tri‐ton X-100（PBS配制）室溫破膜15 min，再用PBS浸洗3次，每次5 min。之后用山羊血清封閉0.5 h。去除封閉液后加入PBS浸洗3次，每次5 min。加入相應的一抗稀釋液（5%BSA稀釋1∶300），靜置4℃冰箱過夜。第2天回收一抗，加入PBS浸洗3次，每次5 min。然后加入對應的熒光二抗稀釋液（PBS稀釋1∶1 000）室溫避光1 h。再用PBS避光清洗3次，每次5 min。接著加入DAPI染色液（PBS稀釋1∶2 000）室溫避光10 min。去除DAPI并加入PBS避光清洗3次，每次5 min。最后，準備好載玻片，并于每張載體玻片中央滴加50 μl抗淬滅封片液，隨后將蓋玻片倒扣于封片液上，4℃避光保存。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，并拍照記錄結果。

1.3 統計學處理使用GraphPad Prism 8.3.0軟件分析統計數據信息。所有數據均顯示為±s。兩組間的比較采用雙尾t檢驗，多組數據間的比較采用單因素方差分析，P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物及疾病靶點的收集在Chembl數據庫收集到20個花青素靶點，在CTD數據庫中收集到26個花青素靶點，在SwissTargetPrediction平臺收集到99個花青素靶點。去重合并后共獲得139個花青素人源靶點。在OMIM數據庫和Genecards數據庫中共收集到2 006個AD人源靶點。藥物靶點和疾病靶點的交集情況用韋恩圖表示，見圖1A。

2.2 PPI網絡以及核心靶點分析將71個交集靶點上傳至STRING平臺即可得到PPI圖，將組織（or‐ganism）設置為“Homo sapiens”，文件以tsv格式保存，將71個交集靶點的相互作用信息上傳至Cyto‐scape 3.7.2軟件進行可視化，并利用MCC算法篩選出10個hub基因。PPI網絡（見圖1B）由71個節點，562條邊構成，其中MCC算法排名前10的靶點依次為：血管內皮生長因子A（VEGFA），IL-6，原癌基因酪氨酸蛋白激酶src（SRC），腫瘤壞死因子（TNF），信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3），人前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2），基質金屬蛋白酶9（MMP9），表皮生長因子（EGFR），雌激素受體alpha（ESR1），絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT（AKT1）。這10個hub靶點顏色隨著MCC分數從黃色到紅色變化，靶點越接近紅色，MCC分數越高。網絡中靶點的拓撲分析數據見表1。

表1 核心靶點在網絡中的拓撲分析（度值排序前10個靶點）Tab.1 Topological analysis of core targets in network(top 10 targets in degree ranking)

圖1 花青素與AD疾病靶點的韋恩圖和交集靶點的PPI網絡Fig.1 Venn diagram of cyanidin and AD targets and PPI network of intersection targets

2.3 GO富集分析GO（gene ontology）可從功能、參與的生物途徑、細胞中的定位，對基因產物進行簡單注釋，因此，通過GO富集分析可以大致了解基因富集在哪些生物學功能、途徑或細胞定位，為后續研究奠定基礎。本研究使用Metascape平臺進行GO富集分析共得到1 671個條目（P<0.05），其中包含1 517個生物進程（BP）條目，66個細胞組成（CC）條目，88個分子功能（MF）條目，并展示各部分富集基因數排名前15的通路，見圖2。不同的顏色代表不同的部分，不同的柱子高度代表不同的基因富集數，柱子越高，代表基因在通路富集越顯著。在生物進程（GO-BP）分析中，基因主要富集在細胞運動以及細胞參與的各個反應。而通過細胞組分（GOCC）分析，可以了解到，花青素治療AD的靶點大多集中在膜區、突觸和軸突區。在分子功能（GO-MF）分析中可以看出，靶點與各類激酶反應相關。

圖2 花青素與AD交集靶點的GO富集分析圖Fig.2 GO enrichment analysis of intersection target of cyanidin and AD

2.4 KEGG通路富集分析通過使用Metascape平臺進行KEGG通路富集分析，共得到220條KEGG信號通路。圖3展示了富集基因數排名前13的通路。縱坐標表示通路名，橫坐標代表富集倍數，氣泡大小代表富集在通路的基因數，顏色代表P值。結果顯示，靶點主要富集在PI3K/AKT信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、MAPK信號通路等。隨后，從Metascape平臺上下載的metascape_result.xlsx文件中挑選出與10個hub基因相關的通路，并用弦圖展示，見圖4。可見PTGS2和TNF與AD通路聯系緊密，為后續研究提供依據。

圖3 花青素與AD交集靶點的KEGG通路圖Fig.3 KEGG pathway diagram of intersection target of cyanidin and AD

圖4 10個hub基因的KEGG通路圖Fig.4 KEGG pathway diagram of 10 hub genes

2.5 花青素與核心靶點PTGS2的分子對接及分子動力學研究炎癥反應可在AD的病理生理學中起至關重要的作用，研究表明，Aβ可激活小膠質細胞，加劇神經炎癥，導致AD的發生和發展，而促炎性酶如環氧合酶-2（COX2，即PTGS2）的過度表達會危及大腦神經元的存活［27-29］。本研究發現PTGS2為花青素治療AD的關鍵靶點，且PTGS2與AD通路聯系緊密。因此，為了進一步探討花青素與PTGS2的結合效果，使用分子對接技術進行研究。在本次對接研究中，選擇的活性位點是Leu338、Ser339、Arg499、Phe504和Val509，從圖5A中看出花青素與活性位點中的Leu338形成了氫鍵作用；而從圖5B中可以看到花青素與殘基Leu338形成氫鍵相互作用（鍵長2.77?），與Tyr341、His75、Arg499、Ser339和Val509以及Phe504等殘基形成疏水相互作用；另外，花青素與PTGS2的結合能為-8.441 kcal/mol。因此，從相互作用和結合能數值可以發現，花青素與PTGS2形成了很緊密的結合，在結合強度方面表現非常良好。

圖5 花青素與PTGS2活性位點的結合模式以及復合物體系的RMSD和RMSF圖Fig.5 Binding mode of cyanidin and PTGS2 active sites and RMSD and RMSF of complex system

通過分子對接，發現花青素與PTGS2結合效果較好，因此，進一步使用分子動力學仿真模擬技術檢測花青素與PTGS2復合物的穩定性和靈活性。分子動力學后，課題組獲得了PTGS2和花青素在蛋白質方面的RMSD和RMSF的數據，其中與第一幀相比，PTGS2和花青素在100 ns的模擬過程中最終在7 ns平衡，并且RMSD數值為0.225 nm，說明PTGS2和花青素的體系很快達到了穩定且并未出現過多的波動（圖5C），而在RMSF方面可以看到整體的RMSF數值處于0.05 nm到0.45 nm之間（圖5D），而形成氫鍵的殘基Leu338中RMSF的數值為0.1 nm，這說明氫鍵起到了限制Leu338的靈活性的作用。

2.6 花青素對LPS誘導的BV2細胞中PTGS2蛋白表達的影響采用LPS誘導BV2細胞建立神經炎癥模型，隨后通過Western blot以及免疫熒光法檢測花青素對LPS誘導的BV2細胞中PTGS2蛋白表達的影響。如圖6所示，與空白對照組相比，LPS組PTGS2蛋白表達明顯增高，花青素預處理后明顯降低。

圖6 Western blot和免疫熒光法檢測PTGS2蛋白的表達Fig.6 Western blot and immunofluorescence detected expression of PTGS2

3 討論

作為一種由多種因素引起的復雜疾病，AD的病因和發病機制尚不清楚，而目前用于治療AD的藥物只能在一定程度上緩解AD的癥狀，且治療效果并不理想，副作用嚴重［6］。花青素是一種常見黃酮類化合物，因其在中樞神經系統中的神經保護作用而備受關注［7-9］。因此，為了更好探索花青素治療AD的機制，本課題組通過網絡藥理學和分子對接的方法對花青素治療AD的可能作用靶點及作用機制進行了綜合研究。

通過對花青素作用靶點與AD疾病靶點進行交集分析，可發現71個共同靶點，這提示花青素可能具有抗AD的作用。進一步結合PPI網絡拓撲分析結果發現，VEGFA、IL-6、SRC、TNF、STAT3、PTGS2以及AKT1等是該網絡的關鍵靶點。通過分析10個hub基因的富集通路發現，PTGS2和TNF與AD通路聯系緊密。PTGS2（即COX-2）是催化花生四烯酸轉化為前列腺素的酶，可在AD病理生理學和神經退行性變中產生有害作用［30］。據文獻報道，在中樞神經系統中，COX-1可在神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞中組成性表達，而在病理生理條件下，COX-2在上述細胞中表達上調，并且COX-2抑制劑在AD、中風、帕金森病、多發性硬化癥和精神分裂癥等疾病的體內外模型中均顯示出神經保護作用，這提示COX產物具有神經毒性。研究還發現，COX-2可誘導神經炎癥介導秋水仙堿誘導的AD大鼠模型的記憶損害和神經退行性變［31-32］。以上結果提示抑制COX-2表達可能在花青素治療AD中發揮關鍵作用。因此，本研究通過分子對接技術以及體外實驗進一步驗證花青素對PTGS2的影響。分子對接結果顯示，花青素與PTGS2可形成良好結合，且穩定性較好。同時，體外實驗結果也顯示，在LPS誘導的BV2細胞神經炎癥模型中，花青素可顯著降低PTGS2蛋白的表達，這證明了網絡藥理學預測的準確性，也再次說明PTGS2對于花青素治療AD的關鍵性。此外，研究也表明，在AD疾病進展過程中，細胞因子如TNF-α、IL-6可通過淀粉樣斑塊沉積加重神經炎癥過程，從而產生細胞毒性作用，最終可能導致神經元死亡［33］。綜上，花青素可能通過作用于PTGS2、IL-6、TNF等多個靶點減輕神經炎癥，從而對AD發揮治療作用。

通過對交集靶點進行GO富集分析，從功能、參與的生物途徑和細胞中的定位對基因產物進行了簡單注釋。從分子功能富集結果分析，花青素治療AD主要體現為與各類激酶反應；從細胞組分結果分析，花青素治療AD的靶點大多集中在膜區、突觸和軸突區；從生物進程富集結果分析，花青素治療AD的靶點主要富集在細胞運動以及細胞參與的各個反應。以上結果提示花青素可能作用于多細胞組分參與不同細胞反應過程，從而發揮治療AD的功效。

淀粉樣斑塊和神經纖維纏結是AD的重要病理特征，細胞外Aβ沉積所引起的細胞內Ca2+超載、氧化應激、神經炎癥、細胞凋亡等最終可導致神經元丟失［34-35］。在本研究中，KEGG通路富集分析結果顯示，花青素治療AD可能與PI3K/AKT信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、MAPK信號通路等多條通路密切相關。PI3K/AKT信號通路是最重要的信號通路之一，在多種信號轉導和細胞功能中發揮關鍵作用。研究表明，PI3K/AKT通路可參與調控細胞周期生長、細胞遷移、凋亡和自噬等不同的細胞功能［36-37］。AKT是一種抑制凋亡信號通路的關鍵促生存因子，AKT磷酸化可抑制下游促凋亡因子Bax，上調下游抗凋亡因子Bcl2，最終抑制細胞凋亡［38］。此外，研究還發現，天然膳食花色苷（anthocy‐anins）可通過PI3K/AKT/Nrf2/HO-1途徑減輕AD小鼠模型的氧化應激、神經退行性變和記憶障礙［39］。MAPK是慢性炎癥性疾病的關鍵靶點，多個體內外實驗表明，p38 MAPK能夠協調多種與AD相關的事件，如tau蛋白磷酸化、神經炎癥、神經毒性和突觸功能障礙等［40-41］。因此，抑制p38 MAPK被認為是治療AD的一種有前景的策略。此外，研究發現，Rap1信號通路和Ras信號通路也與AD的發病機制密切相關［42］。因此，基于文獻報道和本研究網絡藥理學的分析結果，預測花青素可能通過調控PI3K/AKT、MAPK等多條信號通路來抑制細胞凋亡和氧化應激，減輕神經炎癥以及調節tau蛋白，從而發揮治療AD的作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學和分子對接的方法分析了花青素治療AD的潛在靶點及調控分子機制，通過篩選得到71個潛在作用靶點，主要涉及PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路等，揭示花青素可能通過減輕神經炎癥反應、抑制細胞凋亡和氧化應激、調節tau蛋白等多種途徑來發揮治療AD的效果，表現出多靶點、多通路的作用特點。本研究通過結合文獻研究、網絡分析、分子對接、細胞實驗，對花青素治療AD的關鍵作用靶點和相關信號通路進行了探索性研究，為花青素治療AD的進一步研究及其相關產品的開發提供依據。