針刺改善原發性失眠代謝組學研究

崔瑩雪，敖與天，孫敬青

1 首都醫科大學附屬北京中醫醫院 北京 100010

2 北京中醫藥大學 北京 100029

原發性失眠是臨床上最常見的睡眠障礙之一。長期失眠可增加罹患其他疾病的風險，影響人們的生活質量和身心健康，造成個人、社會的嚴重經濟損失[1-2]。

針刺療法是治療失眠的非藥物療法之一[3]。代謝組學通過定量定性分析生物體內所有的小分子代謝產物，對生物體多種生理病理刺激表達產生的內源物質變化進行描述。

本研究以原發性失眠患者為研究對象，觀察受試者失眠嚴重指數（ISI）及匹茲堡睡眠質量指數（PSQI）在針刺治療前后的變化情況，并通過非靶向代謝組學技術，檢測針刺治療前后受試者的尿液代謝產物的變化。評價針刺治療原發性失眠的療效并探究針刺的潛在作用機制。

資料與方法

1 病例資料

本研究入組首都醫科大學附屬北京中醫醫院原發性失眠患者40例（脫落2例）。經隨機信封隨機分組為針刺組和假針刺組，其中針刺組入組20例，脫落0例，假針刺組入組20例，脫落2例。同時社會招募健康受試者20例（無脫落），3組受試者性別構成比、年齡構成比無統計學差異（P＜0.05）（見表1）。

表1 三組受試者一般資料比較

2 納入標準

2.1 滿足下列有關原發性失眠的所有診斷標準；參照2016版《中國失眠障礙診斷和治療指南》及《國際睡眠障礙分類第3版）》。需同時滿足以下5項：①主訴為以下一種或多種癥狀：入睡困難；睡眠維持困難；早醒；無法在適當的時間上床睡覺；無法獨自睡眠（無父母或陪護者）。②因夜間睡眠困難而出現以下一種或者多種癥狀：疲勞；注意力損害；社交或職業能力下降；緒易激動或易煩躁；日間嗜睡；出現如多動、沖動或攻擊性等行為問題；驅動力、精力或動力缺乏；易犯錯或易出事故；對睡眠感到焦慮。③上述癥狀出現頻次至少每周三次。④上述癥狀無法完全被不合適的睡眠環境或者不合適的睡眠計劃所解釋。⑤上述癥狀無法被其他的睡眠障礙更好地解釋。

2.2 年齡18至65周歲；

2.3 自愿參加本項臨床試驗。

3 排除標準

①診斷頑固性失眠（使用2種以上作用機制的藥物治療失眠無效）；②合并嚴重精神疾病或有自殺傾向；③入組前30天內存在急性應激生活事件；④孕期、哺乳期婦女；⑤合并如心腦血管疾病、肝腎功能異常等嚴重全身性疾病或其他導致失眠的繼發性因素

4 健康受試者

按性別、年齡比例通過招募納入健康受試者。

4.1 納入標準 體檢后無精神類疾病以及嚴重全身性疾病；不符合上述有關原發性失眠的任意一條診斷標準；

4.2 排除標準 孕期、哺乳期婦女；精神類藥物服用史。

5 脫落標準

①未能按規定進行治療；②依從性差，在研究過程中自行退出者。

6 剔除標準

①研究過程中合并使用針對原發性失眠的其他療法者；②研究過程中自行更換治療方案者。

7 臨床干預方案

7.1 針刺組

7.1.1 取穴 百會穴、神庭穴、本神穴、四神聰穴及神門穴（雙）、內關穴（雙）、三陰交穴（雙）。

7.1.2 操作方法 患者取平臥位。選取華佗牌30號針灸針直刺，手法取平補平瀉，以患者局部酸脹感受為度，留針30分鐘。

7.1.3 療程 每周3次，2周為1個療程。

7.2 假針刺組

7.2.1 取穴 參考《國內外針灸研究中非經非穴選取方法評述》，采用非經非穴對照，選擇針刺組穴位旁開非循經線2 cm處針刺。

7.2.2 操作方法 患者平臥位，華佗牌30號1寸針灸針淺刺，均刺入皮膚1-2mm，不采用任何手法。留針30分鐘。

7.2.3 療程 每周3次，2周為1個療程。

7.3 健康組 健康組不采取任何干預手段。

8 觀察指標

記錄針刺組與假針刺組受試者于治療第0天、第14天的ISI、PSQI評分以及研究過程中存在的不良反應等；并對各組受試者留取的尿液樣本中代謝產物進行分析鑒定并對比。健康受試者留取尿液標本1次。尿液標本均留取晨起空腹中段尿，-80 ℃ 冰箱儲存。采用LC-MS非靶向代謝組學法檢測各組受試者尿液中代謝產物情況。

9 統計分析

采用SPSS 21.0軟件統計分析臨床數據，使用均數±標準差表示正態分布計量資料，獨立樣本t檢驗進行兩組比較；非正態分布計量資料使用中位數±四分位距表示，采用非參數檢驗比較兩組數據；以P＜0.05表示具有統計學差異。

代謝組學檢測數據采用Progenesis QI軟件（Waters Corporation，Milford，USA）進行預處理。采用Progenesis QI軟件對原始數據進行搜庫鑒定，主要數據庫為http：//www.hmdb.ca/；https：//metlin.scripps.edu/等公共數據庫及自建數據庫。采用T檢驗結合多元分析法OPLS-DA篩選出組間差異代謝物。

結 果

1 ISI評分比較

基線期兩組患者ISI評分無統計學差異（P＞0.05）。治療后針刺組ISI評分低于假針刺組，且具有統計學差異（P＜0.05）；且針刺組治療后ISI評分低于治療前，具有統計學差異（P＜0.05）。假針刺組治療前后ISI評分無統計學差異（P＞0.05）（見表2）。

表2 各組ISI評分比較

2 PSQI評分比較

基線期兩組PSQI各項評分及總分對比均無統計學差異（P＞0.05）。經針刺治療2周后，針刺組患者在PSQI總分，及日間功能障礙評分、睡眠質量、睡眠時間分項評分均低于假針刺組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

治療后針刺組患者的PSQI總分及入睡時間、睡眠時間、睡眠效率、睡眠質量、睡眠障礙、日間功能障礙等分項評分及均低于基線期，其治療前后評分差異具有統計學意義（P＜0.05）。假針刺組患者治療前后PSQI各項評分治療前后對比均無統計學差異（P＞0.05）（見表3）。

表3 兩組患者PSQI各項評分比較

3 差異代謝物分析

3.1 差異代謝物篩選 采用代謝集Venn分析，篩選出同時滿足失眠患者（針刺組+假針刺組）與健康組存在差異的代謝物共27種，考慮這27種代謝物可能與原發性失眠相關（見圖1）。在上述27種代謝物中，繼續篩選針刺治療前后差異性代謝產物一種：依來曲普坦N-氧化物（Eletriptan N-oxide），分子式：C22H26N2O3S，考慮這種代謝物與針刺治療可能相關。

圖1 代謝物Venn 圖

3.2 通路分析 利用KEGG（京都基因與基因組百科全書）數據庫進行功能通路分析（見圖2）。進一步采用美吉生物云平臺自主研發的流程進行KEGG Pathway富集分析。得到5個可能與失眠相關的代謝通路，包括：咖啡因代謝、甘油磷脂代謝、泛酸和輔酶A的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、嘌呤代謝（見圖3）。

圖2 KEGG功能通路

圖3 KEGG拓撲學分析

討 論

《素問·寶命全形論》：“凡刺之真，必先治神。”《靈樞·本神》：“凡刺之本，先必本于神。”可見，針灸的調神作用是治療疾病的基礎。本研究選穴為我院國家級名老中醫周德安教授經驗方“四神方”，這一針刺方中所包含的神庭、神門、本神、四神聰等穴位，是針灸調神的經驗穴。頭為諸陽之會，百會穴位于頭頂，是百脈朝會的部位，所以百會穴能夠起到升陽益氣、鎮靜安神的作用。百會、神庭均屬于位于督脈上，督脈“入屬于腦”，腦為元神之府，二穴相配伍，常用于治療失眠、躁狂等神志病。周德安教授認為失眠當從心、肝、脾、腎論治，故選穴加用三陰交穴以健脾、疏肝、益腎，選取心經原穴神門及心包經絡穴內關穴相配以清心安神[4-5]。

本研究通過觀察ISI、PSQI量表評分發現，針刺調神方對于原發性失眠患者睡眠質量、睡眠時間與日間功能具有改善作用。該研究結論與既往文獻報道相似，如研究發現，針刺三陰交、四神聰穴可改善失眠患者的睡眠質量，延長睡眠時間、提高睡眠效率[6-7]。

本研究篩選出27種與原發性失眠相關的潛在代謝物，主要涉及的代謝通路為咖啡因代謝、甘油磷脂代謝、泛酸和輔酶A的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、嘌呤代謝等。同時篩選出1種可能與針刺治療相關的代謝物： Eletriptan N-oxide，該物質是依來曲普坦的代謝產物，是有效的5-HT受體激動劑（包括神經元5-HT1D和血管選擇性5-HT1B受體），并可透過血腦屏障[8]。5-HT（5-羥色胺）是一種中樞神經遞質，主要調節睡眠、情緒、記憶等，是多種抗抑郁藥、抗偏頭痛藥物的作用靶點[9]。多項研究表明，針刺對人體5-HT水平具有調控作用，包括可能通過調節血清5-HT水平從而起到治療抑郁癥[10，11]、偏頭痛[12]、睡眠障礙[13-17]等疾病的作用。另有研究認為，針刺可通過調控大鼠的5-HT受體的表達、調控5-HT受體間的平衡從而發揮改善情緒、促進睡眠等作用[18-20]。結合本研究結果，推測針刺療法改善原發性失眠的作用可能與調控5-HT代謝相關。

因本研究為代謝組學前期探索性研究，故各組納入樣本量及觀察周期相對不足，后續研究可進一步擴大樣本量，延長治療周期，對研究加以完善。